Summary
Denne protokol beskriver anvendelsen af et nyt hybrid alfavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) som en platform til hurtig kvantificering af infektivitet af SARS-CoV-2-varianter og deres følsomhed over for neutraliserende antistoffer.
Abstract
Coronavirus sygdom 2019-pandemien (COVID-19) har fremhævet behovet for hurtige assays for nøjagtigt at måle infektiviteten af nye SARS-CoV-2-varianter og effektiviteten af vaccineinducerede neutraliserende antistoffer mod virale varianter. Disse analyser er afgørende for pandemisk overvågning og validering af vacciner og variantspecifikke boostere. Dette manuskript demonstrerer anvendelsen af et nyt hybrid alfavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) til hurtig kvantificering af SARS-CoV-2-variantinfektivitet og vaccineinduceret neutraliserende antistoffer mod virale varianter. Ha-CoV-2 er en SARS-CoV-2-viruslignende partikel bestående af virale strukturelle proteiner (S, M, N og E) og et hurtigt udtrykkende RNA-genom afledt af et alfavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 indeholder også både grønt fluorescerende protein (GFP) og luciferase reportergener, der muliggør hurtig kvantificering af viral infektivitet. Som et eksempel kvantificeres infektiviteten af SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) og Omicron (B.1.1.529) varianterne, og deres følsomhed over for et neutraliserende antistof (27VB) måles også. Disse eksempler demonstrerer Ha-CoV-2's store potentiale som en robust platform til hurtig kvantificering af SARS-CoV-2-varianter og deres modtagelighed for neutraliserende antistoffer.
Introduction
Fra maj 2023 har der nu været mere end 766 millioner COVID-19 tilfælde1. På trods af verdensomspændende vaccinationskampagner cirkulerer og inficerer SARS-CoV-2 kontinuerligt mennesker, hovedsageligt på grund af fremkomsten af nye varianter såsom Delta (B.1.617.2) og Omicron (B.1.1.529), der driver nye bølger af infektion 2,3,4. I betragtning af at SARS-CoV-2 konstant udvikler sig, er det vigtigt at udvikle hurtige assays, der nøjagtigt kan måle infektiviteten af nye varianter og effektiviteten af vaccineinducerede neutraliserende antistoffer mod disse varianter. Disse analyser er afgørende for pandemisk overvågning og for at bestemme effektiviteten af vacciner og deres variantspecifikke boostere.
På grund af den meget smitsomme karakter af SARS-CoV-2 kræver Center for sygdomsbekæmpelse og forebyggelse (CDC), at undersøgelsen af SARS-CoV-2 og dens varianter udføres i biosikkerhedsniveau (BSL) 3 faciliteter 5,6. Dette BSL-3-krav begrænser brugen af levende vira til kvantificering af infektiviteten af virale varianter og deres neutraliserende antistoffer i fælles forskning og kliniske laboratorier. Derudover er traditionelle SARS-CoV-2-neutraliseringsassays, såsom de plaque- eller cytopatiske effektbaserede assays ved hjælp af replikationskompetente levende vira, tidskrævende og kræver lange inkubationsperioder7. Flere spike (S) protein-pseudotypede SARS-CoV-2 pseudovira er blevet udviklet til at kvantificere effektiviteten af neutraliserende antistoffer 8,9,10,11,12. I SARS-CoV-2 er S-proteinet det vigtigste protein, der medierer viral indgang13, og er det vigtigste antigen, der anvendes i SARS-CoV-2-vacciner 9,10,14,15,16. S-protein-pseudotypede virioner, såsom dem af vesikulær stomatitisvirus (VSV-G) eller lentivirus, er blevet anvendt til kvantificering af neutraliserende antistoffer 17,18,19. Ikke desto mindre kræver det lentivirusbaserede pseudovirus normalt 2 til 3 dages infektion for at kvantificere reportersignaler. VSV-baserede pseudovirussystemer indeholder ofte resterende VSV-virus, hvilket kan resultere i høje satser for falsk-positive resultater og typisk kræver 24 timers infektion20.
Et nyt SARS-CoV-2 pseudovirussystem, hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2), er for nylig blevet udviklet af Hetrick et al12. Ha-CoV-2 giver et nyt værktøj til hurtig kvantificering af virusinfektivitet og virusfølsomhed over for neutraliserende antistoffer i almindelige BSL-2-laboratorier. Strukturelt ligner Ha-CoV-2 SARS-CoV-2 virionpartiklen, der består af SARS-CoV-2 strukturelle proteiner inklusive S-proteinet (S), membranen (M), nukleocapsidet (N) og konvolutten (E), og der er intet strukturelt protein fra andre vira. Derudover indeholder Ha-CoV-2-partiklen et hurtigt ekspresserende RNA-genom fra et alfavirus til hurtig reporterekspression i celler. Ha- CoV-2 har vist sig hurtigt at måle den neutraliserende aktivitet af antistoffer i sera hos vaccinerede og rekonvalescent individer12. Som demonstreret af Hetrick et al., sammenlignet med lentivirusbaseret SARS-CoV-2 pseudovirus i et tidsforløbsassay, udtrykte Ha-CoV-2 Luc-reporteren så tidligt som 2-4 timer efter infektion, mens lentivirus-pseudovirus udtrykte Luc efter 24 timer12. Derudover demonstreres den potentielle anvendelse af Ha-CoV-2-varianter til kvantificering af neutraliserende antistoffer yderligere ved anvendelse af et standard monoklonalt neutraliserende antistof, 27BV (se supplerende figur 1)12. Dette arbejde beskriver brugen af Ha-CoV-2-platformen til hurtig kvantificering af smitsomheden af SARS-CoV-2-varianter ved hjælp af Delta (B.1.617.2) og Omicron (B.1.1.529) varianterne som eksempler. Derudover demonstreres den potentielle anvendelse af Ha-CoV-2-varianter til kvantificering af neutraliserende antistoffer yderligere ved anvendelse af et standard monoklonalt neutraliserende antistof, 27BV12.
Protocol
1. Virus og viral partikelsamling
- Vektorer: Køb ekspressionsvektorer til SARS-CoV-2 M, E eller N samt SARS-CoV-2 S (Wild-type, Wt), Delta (B.1.617.2) og Omicron (B.1.1.529) kommercielt.
BEMÆRK: Proteinsekvenser af ekspressionsvektorerne findes i supplerende fil 1. Sælgeren af disse udtryksvektorer kan også findes under materialetabellen. - Celler og cellekultur: Oprethold HEK293T celler i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM), der indeholder 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 50 enheder / ml penicillin og 50 μg / ml streptomycin.
BEMÆRK: Alt cellekulturarbejde skal udføres i et laminært biosikkerhedsskab til luftstrøm. Polyethyleneimin (PEI) transfektion kræver typisk 5-6 timers inkubation. Starttider skal overvejes nøje på forhånd. - Virussamling og PEI-baseret cotransfektion: Saml Ha-CoV-2-partikler ved cotransfektion af HEK293T celler. Frøceller i en 10 cm cellekultur petriskål (4-5 x 106 celler pr. skål) i 10 ml komplet DMEM-medium dagen før cotransfektion. Til denne undersøgelse bruges tre petriskåle til frøceller til samling af henholdsvis Ha-CoV-2 vildtype, Delta og Omicron.
- Petriskåle inkuberes natten over i en CO2 -inkubator ved 37 ° C. Tjek opvasken næste morgen for at sikre, at cellerne er 80% sammenflydende. Fjern hele mediet, og erstat det med 9 ml DMEM-serumfrit medie.
- For hver skål fremstilles en cotransfektionsblanding med 2,5 μg af hver af SARS-CoV-2 strukturelle proteinekspressionsvektorer (N, E, M), 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (HaCoV2-genom) og 2,5 μg af S-proteinekspressionsvektoren, enten Delta- eller Omicron S-varianterne og 45 μL PEI-baseret transfektionsreagens. Lad cotransfektionsblandingen danne komplekser ved inkubation i 13 minutter (inkuber ikke i mere end 30 minutter).
- Efter inkubation tilsættes cotransfektionsblandingen langsomt til hver petriskål, dråbe for dråbe. Opvasken anbringes i en CO2 -inkubator ved 37 °C i 6 timer. Efter 6 timer fjernes serumfri DMEM, og den erstattes med komplet DMEM-medium. Høstvirus ved 48-60 timer efter cotransfektion.
- Virus høst og opbevaring: Høst partikler 48 timer efter cotransfection. Afmonter celler ved pipettering gentagne gange over overfladen af monolaget, og opsaml celler fra hver skål, kom i 15 ml centrifugeglas og centrifuger ved 400 x g i 5 min. Supernatanten opsamles og ledes gennem et 0,22 μM filter. Opbevar Ha-CoV-2 pseudovirus ved -80 °C.
2. Viral infektivitetsanalyse
- Celler og cellekultur: Oprethold HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) indeholdende 10% varmeinaktiveret FBS, 50 enheder / ml penicillin og 50 μg / ml streptomycin.
- Såning HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler: Dagen før viral infektivitetsanalyse frø HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler i en 96-brøndplade i 50 μL komplette DMEM-medier. For hver 96-brøndplade frø 2,5 x 104 celler i hver brønd, og i alt 2,5 x 106 celler er nødvendige for en plade. 96 brøndpladen anbringes i en CO2 -inkubator ved 37 °C natten over.
- Infektion af HEK293T (ACE2 / TMPRSS2): Brug Ha-CoV-2 varianter partikler til at inficere HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler. Om morgenen for infektion fjernes 50 μL DMEM fra præ-podet 96 brøndplade. Udskift medier med 50 μL af enten Ha-CoV-2 Wild-type, Delta eller Omicron i 18 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: Protokollen kan stoppes her, indtil infektionen har nået 18 timers inkubation, og pladen er klar til at blive analyseret via Luciferase-assay. Infektionens succes bestemmes af Luciferase-analysen som følge af Luciferase-reportergenet udtrykt i de inficerede celler, derfor jo mere signal der produceres, jo mere vellykket er infektionen af Ha-CoV-2-varianten. - Luciferase-analyse: Efter 18 timers inkubation tilsættes 7,5 μL cellelysebuffer direkte til hvert hul og blandes ved orbitalomrystning i 2 min. Lysér celler i lysisbuffer i mindst 5 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered Firefly luciferase assayopløsningen ved at blande D-luciferinopløsningen med Firefly luciferase assayopløsningen i forholdet 1:50. For en hel plade med 96 huller kombineres 3 ml luciferasesubstratopløsningen med 60 μL af D-luciferinopløsningen med 2940 μL Firefly luciferase-bufferopløsningen.
- Der tilsættes 25 μL Firefly luciferase assayopløsning til cellelysaterne og blandes pladen ved orbitalomrystning i 1 min. Analysér luciferaseaktiviteten ved hjælp af en kommerciel luciferase-mikropladelæser.
3. RNA-ekstraktion af Ha-CoV-2 og kvantitativ revers transkriptase PCR (RT-qPCR)
- Viral RNA-ekstraktion: Uddrag det virale RNA fra Ha-CoV-2 Wild-type og Ha-CoV-2 Delta og Omicron variantpartiklerne ved hjælp af et kommercielt viralt RNA-ekstraktionssæt efter producentens anvisninger. Opbevar det ekstraherede virale RNA ved -80 °C eller brug det straks til RT-qPCR.
- RT-qPCR: Udfør RT-qPCR på viralt RNA ved hjælp af en et-trins masterblanding. Udfør reaktionen i en kommerciel PCR-maskine. Bemærk, at målet for amplifikation er det genomiske RNA af Ha-CoV-2. Brug Ha-CoV-2 vektor-DNA som standard til at skabe en standardkurve og beregne RNA-kopinummeret for hver variant.
4. Neutraliserende antistofanalyse
- Såning HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler: Dagen før analysen frø HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler i en 96 brøndplade i 50 μL komplette DMEM-medier. HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler købes kommercielt.
- Til tælling af celler udtages 20 μL celler fra en T75-kolbe indeholdende HEK293T(ACE2/TMPRSS2) celler, og blandes med 20 μL trypanblå opløsning. Der tilsættes 20 μL af denne blanding til celletællekammeret, og antallet af celler pr. ml tælles. For at frø en 96 brøndplade til infektion skal du bruge 2,5 x 104 celler pr. Brønd, og 2,5 x 106 celler vil være nødvendige i alt. 96 brøndplade anbringes i en CO2 -inkubator ved 37 °C natten over.
- Neutraliserende antistofanalyse: I en steril polypropylen 96-brøndplade fremstilles standard 27BV neutraliserende antistof og Ha-CoV-2-blanding. Der tilsættes 8 μL 27BV (45 mg/ml) til pladen, og der udføres serielle fortyndinger af antistoffet med 6 μL serumfrit DMEM.
BEMÆRK: Sørg for at udveksle pipettespidser mellem brøndoverførsler, og sørg for, at antistoffet og serumfrit medium blandes grundigt for at give nøjagtige resultater. - Til det serielt fortyndede antistof tilsættes 54 μL Ha-CoV-2-partikel og blandes virussen og antistoffet. Ha-CoV-2-partikler præinkuberes serielt fortyndet 27 BV i 1 time ved 37 °C ved 5 % CO2. Efter inkubationen på 1 time påføres 50 μL af antistoffet og Ha-CoV-2-blandingen på 96-brøndpladen indeholdende de HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler (2,5 x 104 celler pr. Brønd), der blev podet dagen før.
- Til kontrollerne efterlades mindst tre huller, der kun indeholder cellerne HEK293T (ACE2/TMPRSS2). Der tilsættes 50 μL komplet substrat til disse huller for at tjene som ikke-inficerede huller til baggrundssignal for luciferase-analyseaflæsningerne.
BEMÆRK: Protokollen kan stoppes her, indtil infektionen har nået 18 timers inkubation ved 37 °C, og derefter er pladen klar til at blive analyseret via luciferase-assay. - Luciferase-analyse: Efter 18 timers inkubation tilsættes 7,5 μL lysisbuffer direkte til hvert hul og blandes ved orbitalomrystning i 2 min. Lysér celler i lysisbuffer i mindst 5 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered Firefly luciferase assayopløsningen ved at blande D-luciferinopløsningen med Firefly luciferase assayopløsningen i forholdet 1:50. For en hel plade med 96 huller kombineres 3 ml luciferasesubstratopløsningen med 60 μL af D-luciferinopløsningen med 2940 μL af firefly luciferase-bufferopløsningen.
- Der tilsættes 25 μL Firefly luciferase assayopløsning til cellelysaterne og blandes pladen ved orbitalomrystning i 1 min. Analysér luciferaseaktiviteten ved hjælp af en kommerciel luciferase-mikropladelæser.
5. Kvantificering og statistisk analyse
- Dataindsamling: Udfør infektions- og luciferaseanalyser i tre eksemplarer som angivet (figur 1). Kvantificer luciferase-ekspression med luciferase-analyseaflæsninger. Middelværdien er gennemsnitsværdien af de tre luciferase-assayaflæsninger. Baggrundssignalaflæsninger fra ikke-inficerede brønde trækkes fra denne middelværdi. Standardafvigelse (SD) bestemmes ud fra gennemsnitsværdien af luciferase-assayaflæsningerne.
- Dataanalyse: Plot antistofneutraliseringsaktivitet og beregn ID50-værdierne (50% hæmningsdosis) ved hjælp af kommerciel grafsoftware. ID50-værdien defineres som de antistofhæmmende fortyndinger, ved hvilke der opnås en 50% reduktion i infektionen af HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler (baseret på luciferase-assayaflæsninger).
Representative Results
Ha-CoV-2-partikler blev samlet ved hjælp af fem forskellige DNA-vektorer, der udtrykker Ha-CoV-2 RNA-genomet og de strukturelle proteiner (M, N, E og S) af SARS-CoV-2 i HEK293T celler. S-proteinvektoren varierer afhængigt af S-varianten. S-proteinet fra den oprindelige Ha-CoV-2 Wuhan-stamme (Wild-type, Wt) blev brugt som en positiv kontrol, og det blev samlet sammen med S-proteinet fra hver af de to andre varianter: Delta (B.1.617.2) eller Omicron (B.1.1.529). Den samme M, N, E blev brugt i alle varianter. Ha-CoV-2 (Wt) og variantpartikler blev opsamlet 48 timer efter cotransfektion og derefter brugt til at inficere HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler. Infektivitet blev målt ved ekspression af luciferase 18 timer efter infektion. I dette system afspejler højere ekspressionsniveauer af luciferasesignal en højere infektion af celler med Ha-CoV-2. Luciferasesignalet blev normaliseret med genomiske RNA-kopier af RT-qPCR for hver variant. Som vist i figur 1 genererede Ha-CoV-2 Omicron-varianten 4 til 10 gange højere signal end den oprindelige Ha-CoV-2 (Wt), hvilket tyder på en højere smitsomhed.
Desuden blev kapaciteten på 27BV til at neutralisere HaCoV-2 (Wt), Delta og Omicron varianter kvantificeret. 27BV er et kaninmonoklonalt antistof, der blev udviklet mod RBD-domænet af SARS-COV-2 S1-proteinet. Til neutraliseringsassays blev serielle fortyndinger af 27BV udført i en 96-brøndplade, præinkuberet med Ha-CoV-2 og derefter tilsat til HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) målceller. Resultaterne viste, at 27BV havde neutraliserende aktivitet mod alle de testede varianter (figur 2). Interessant nok var ID50 på 27VB for Omicron cirka 10 gange mindre potent end ID50 for Ha-CoV-2 (WT) og Ha-CoV-2 (Delta; Figur 2). Disse resultater viser, at Ha-COV-2-platformen kan bruges som en hurtig metode til kvantificering af vaccineinducerede neutraliserende antistoffer i nye varianter.
Figur 1. Samling og kvantificering af Ha-CoV-2-varianter. A) Illustration af samlingen af Ha-CoV-2 og variantpartikler. Vektorerne, der udtrykker Ha-CoV-2-reportergenomet og strukturelle proteiner (M, S, N og E), cotransfekteres i HEK293T celler. Partikler blev høstet 48 timer efter cotransfektion (billeddannelse af virionpartikel- og HEK293T-celler blev skabt med Biorender.com). B) Kvantificering af smitsomheden af Ha-CoV-2-varianter. Den relative infektivitet af de to varianter (Delta og Omicron) kvantificeres og normaliseres ved hjælp af genomiske RNA-kopier af individuelle Ha-CoV-2 (Luc) varianter. Wild-type er Ha-COV-2 (Wt), som bruges som kontrol til sammenligning. Infektion og luciferase assays blev udført 3x. RU, relativ enhed. Middel- og standardafvigelsen (SD) vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Kvantificering af 27BV neutraliseringsaktivitet mod Ha-CoV-2 (Luc) varianter Neutraliseringsaktivitet på 27BV blev analyseret 18 timer efter infektion af HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler. ID50 blev beregnet ved hjælp af relativ infektionshastighed (luciferaseaktivitet) versus 27BV koncentration. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Infektion af HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) med Ha-CoV-2 (GFP). Ha-CoV-2 (GFP) partikler blev samlet og derefter brugt til at inficere HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler. GFP-ekspression blev observeret 48 timer efter infektion ved anvendelse af fluorescerende mikroskopi. Det hvide felt af inficerede celler vises til venstre, og GFP-billeddannelse vises til højre. Den hvide bjælke repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1. Grafisk abstrakt. Ha-CoV-2 pseudovirus struktur og anvendelse. Billede oprettet med Biorender.com. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende dossier 1. Protein sekvenser. Liste over sekvenserne af SARS-CoV-2 S-, M-, N- og E-proteiner. S-proteinsekvenserne inkluderer også SARS-CoV-2-varianterne Omicron (B.1.1.529) og Delta (B.1.617.2). Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Ha-CoV-2-platformen giver en hurtig, robust og enkel arbejdsgang til at kvantificere virale varianter og neutralisere antistoffer. Der er dog et par kritiske trin, der kræver opmærksomhed. Produktionen af Ha-CoV-2 pseudovirus bør udføres ved anvendelse af HEK293T celler med høj levedygtighed. Cotransfektionseffektiviteten kan overvåges 24 timer efter transfektion ved hjælp af GFP-reportergenet fra Ha-CoV-2-genomet. Ha-CoV-2-genomet kan indeholde to reportere (GFP og Luc), og GFP kan udtrykkes under cotransfektion og efter Ha-CoV-2-infektion af målceller12. GFP + -cellerne fra infektion er normalt på en lav procentdel (1% til 5%), men hver inficeret celle udtrykker stærke GFP-signaler (figur 3). Denne lave GFP-procentdel kan begrænse brugen af GFP som en robust aflæsning til kvantificering af antistofneutralisering sammenlignet med Luc-reporteren, der kvantificerer hele populationen af inficerede celler.
Når du udfører neutraliseringsanalysen, er det vigtigt at skifte pipettespidser mellem brøndoverførsler og sikre, at antistoffet og serumfrit medium blandes grundigt for at give nøjagtige resultater. Derudover skal cellerne ved udførelse af luciferase-assayprotokollen være fuldt lyseret i mindst 3 minutter for at sikre fuldstændig lysering af celler og frigivelse af luciferaseenzymet. Dette vil sikre nøjagtigheden af analysen. Derudover, når Firefly luciferase assay-opløsningen er tilsat til de optiske hvidvæggede 96 brøndplader, skal pladen analyseres inden for 10 minutter, da den indledende lysemission er høj, men falder over tid, da ATP er udtømt21.
Efterhånden som flere SARS-CoV-2-varianter fortsætter med at udvikle sig, er der et øget behov for platforme som Ha-CoV-2 til hurtigt at screene for variantinfektivitet og variantfølsomhed over for vaccineinducerede neutraliserende antistoffer. Ha-CoV-2-platformen tilbyder hurtigere hastighed, et højere signal-støj-forhold og en simpel protokol sammenlignet med eksisterende pseudovirusbaserede neutraliseringsassays 8,9,10,11. Ha-CoV-2-platformen giver også den fordel, at den kan bruges i BSL-2-laboratorier og ikke kræver brug af BSL-3-faciliteter. Dette gør det muligt at forske i SARS-CoV-2 i fælles forskningslaboratorier og kliniske laboratorier. Desuden producerer Ha-CoV-2-platformen hurtige resultater sammenlignet med andre systemer. For eksempel gør undersøgelsen af neutraliserende antistoffer mod infektiøs SARS-CoV-2-virus ofte brug af plaquereduktionsneutraliseringstesten (PRINT)22. Selvom PRINT giver pålidelige resultater, er manuel optælling af plakdannende enheder (PFU'er) langsom og kræver 3-5 dage for at opnå resultater23,24. Andre pseudotypesystemer, såsom lentivirus-pseudovirus, har brug for 24-72 timer for at producere et detekterbart reportersignal12. Til sammenligning kan Ha-CoV-2-neutraliseringsanalysen generere resultater inden for 18 timer. Ha-CoV-2 giver et praktisk værktøj til hurtig screening og kvantificering af virale varianter og neutraliserende antistoffer til pandemiovervågning.
Overvågning af smitsomheden af sars-CoV-2 er afgørende, da flere varianter af bekymring (VOC'er) fortsætter med at dukke op. Ha-CoV-2 giver fordelen ved hurtigt at bestemme VOC'ernes infektivitet. Tidligere undersøgelser har brugt kunstig intelligens (AI) -baseret modellering til kvantitativt at analysere infektiviteten af Omicron-undervarianten og de andre SARS-CoV-2-varianter, såsom Delta -varianten25. Disse undersøgelser har vist, at Omicron-varianten er mere smitsom end den oprindelige virus og mere tilbøjelig til at undslippe neutraliserende antistoffer25. I disse undersøgelser blev der ved anvendelse af Ha-CoV-2 observeret lignende fænotyper. Derudover er Omicron-varianten i antistofneutraliseringsanalyserne ti gange mindre tilbøjelige til at blive neutraliseret med 27BV end Wuhan- og Delta-stammerne. Disse resultater er også i overensstemmelse med den rapporterede højere overførbarhed af Omicron-varianten, som har mindst 15 mutationer på sit receptorbindingsdomæne (RBD), hvilket sandsynligvis forbedrer viral bindingsaffinitet til ACE2-receptoren for højere overførbarhed og større immunflugt26.
Disclosures
Et patent er blevet indgivet af George Mason University og licenseret til Virongy Biosciences Inc. til produktudvikling. Y.W. er grundlægger og medlem af det rådgivende udvalg for Virongy Biosciences. BH er i øjeblikket administrerende direktør og Chief Scientific Officer for Virongy Biosciences. Forfatterne har ingen andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af George Mason University interne forskningsfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody | Virongy Biosciences | 27VBI-01 | |
| 500 mL - US Origin FBS | Neuromics | FBS001 | |
| AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit | Genesee Scientific | Cat# 24-300 | |
| Allegra 6R Centrifuge | Beckman Coulter | 2043-30-1158 | |
| DMEM (1x) | ThermoFisher | 11995-073 | |
| GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit | Genesee Scientfic | 25-209 | |
| GlowMax Discover Microplate reader | Promega | GM3000 | |
| Ha-CoV-2 E Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_E | |
| Ha-CoV-2 M Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_M | |
| Ha-CoV-2 N Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_N | |
| Ha-CoV-2 WT S Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_WT S | |
| Hek293T cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays | Gold Bio | I-930-1000 | |
| Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney) | VWR | Cat# 82050-758 | |
| pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector | In house | ||
| PEI-based Transfection Reagent | Virongy Biosciences | Transfectin | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Invitrogen | 10378016 | |
| Polyethylenimine, branched | Millipore Sigma | 408727-100ML | |
| QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System | ThermoFisher | A43163 | |
| Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells | Virongy Biosciences | Ready-To-Use-Cells | |
| SARS-CoV-2 S Omicron (B.1.1.529) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2-B.1.1.529 | |
| SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2- B.1.617.2 | |
| Syringe Filters, PES, 0.22µm | Genesee Scientfic | 25-244 | |
| TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | ThermoFisher | 4444432 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 |
References
- World Health Organization. Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1 (2023).
- Dhama, K., et al. Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies. Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).
- Dhama, K., et al.
- El-Shabasy, R. M., et al. Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic. International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).
- CDC. Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/lab-biosafety-guidelines.html (2021).
- Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent. Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).
- Vanderheiden, A., et al. Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies. Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116 (2020).
- Dieterle, M. E., et al. A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition. Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Nie, J., et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).
- Yang, R., et al. Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro. Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).
- Hetrick, B., et al. Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs. Cell reports methods. 2 (3), 100181 (2022).
- Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
- Jackson, L. A., et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report. The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).
- Polack, F. P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
- Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).
- Donofrio, G. A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay. Vaccines. 9 (4), 389 (2021).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
- Zettl, F., et al. Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes. Vaccines. 8 (3), 386 (2020).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963 (2018).
- Lundin, A. Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).
- Deshpande, G. R., et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients. The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).
- Chen, C., et al. Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Analytical Biochemistry. 673, 115199 (2023).
- Manischewitz, J., et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).
- Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).
- Saxena, S. K., et al. Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective. Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).
