Summary
يصف البروتوكول تحريض جذر الشعر باستخدام سيقان الإزهار الأولية Arabidopsis و Brassica napus hypocotyls. يمكن استزراع الجذور المشعرة واستخدامها كنباتات لتجديد النباتات المعدلة وراثيا.
Abstract
يمثل تحويل الجذر المشعر أداة متعددة الاستخدامات للتكنولوجيا الحيوية النباتية في مختلف الأنواع. تؤدي العدوى بسلالة Agrobacterium التي تحمل بلازميد محفز للجذر (Ri) إلى تكوين جذور مشعرة في موقع الجرح بعد نقل T-DNA من بلازميد Ri إلى جينوم النبات. يصف البروتوكول بالتفصيل إجراء تحريض جذر الشعر القائم على الحقن في DH12075 براسيكا نابوس وأرابيدوبسيس ثاليانا كول-0. يمكن استخدام الجذور المشعرة لتحليل جين التحوير ذي الأهمية أو معالجتها لتوليد النباتات المعدلة وراثيا. وسط التجديد الذي يحتوي على السيتوكينين 6-بنزيلامينوبورين (5 مجم / لتر) والأوكسين 1-حمض النفثالين الخليك (8 مجم / لتر) يستحث بنجاح تكوين البراعم في كلا النوعين. يغطي البروتوكول التنميط الجيني واختيار المجديدات ونباتات T1 للحصول على نباتات تحمل جينا محورا مهما وخالية من الحمض النووي التائي من بلازميد Ri . كما تم تصوير عملية بديلة تؤدي إلى تكوين نبات مركب. في هذه الحالة ، يتم الاحتفاظ بالجذور المشعرة على اللقطة (بدلا من الجذور الطبيعية) ، مما يتيح دراسة جين التحوير في ثقافات الجذور المشعرة في سياق النبات بأكمله.
Introduction
تحول النبات هو عنق الزجاجة لأي دراسة وراثية في بيولوجيا النبات. تستخدم البكتيريا التي تنقلها التربة ، Agrobacterium tumefaciens، على نطاق واسع كوسيلة لتوصيل الجينات عن طريق غمس الأزهار أو زراعة الأنسجة لتوليد المحولات. A. tumefaciens يصيب النباتات في موقع الجرح ويسبب الأورام بسبب نقل ودمج T-DNA من البلازميد المسبب للورم (Ti) في جينوم النبات المضيف. تستخدم سلالات A. tumefaciens المهندسة مع بلازميد Ti المعدل بدون T-DNA من النوع البري وناقل ثنائي مع T-DNA الاصطناعي ومواقع الاستنساخ لإدخال جين مهم كنظام فعال لتحويل النبات1. ومع ذلك ، فإن العديد من الأنواع والمحاصيل النموذجية متمردة على غمس الأزهار أو تجديد النباتات في المختبر أو لديها دورات نمو طويلة ، مما يؤثر على كفاءة نظام التحول هذا.
تحفز جذور Agrobacterium الجذرية تكوين جذور عرضية ، أو جذور مشعرة ، في موقع الجرح بعد إصابة نبات مضيف. على غرار A. tumefaciens، تنقل A. rhizogenes الحمض النووي التائي من البلازميد المستحث للجذر (Ri) إلى جينوم النبات المضيف، مما يتسبب في تطور جذور الشعر المعدلة وراثيا. يتم التحكم في هذه العملية بشكل رئيسي عن طريق جينات الجذور المسرطنة (rol) 2,3. باستخدام سلالات زراعية تحمل كلا من بلازميد Ri وناقل ثنائي اصطناعي يشفر جينا مثيرا للاهتمام ، تم استخدام مزارع الجذور المشعرة لإنتاج بروتينات مؤتلفة ، أو تحليل وظيفة المروجين أو الجينات ، أو تحرير الجينوم باستخدام التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPRs) / البروتين المرتبط بكريسبر 9 (Cas9) 4،5،6.
يستخدم بروتوكولنا سلالة Ti-less A. tumefaciens C58C1 التي تحمل بلازميد Ri pRiA4b7. يتكون T-DNA لبلازميد Ri من منطقتين ، اليمين واليسار T-DNA (TR-DNA و TL-DNA ، على التوالي) ، والتي يمكن أن تندمج بشكل مستقل في جينوم النبات8. باستغلال هذا النظام ، تم تحسين عملية تحويل النبات المطولة في صنف Brassica napus DH120759. يسمح البروتوكول المفصل أدناه بتجديد خطوط جذر مشعرة مختارة والحصول على نباتات T1 تحمل جين التحوير ذي الأهمية وخالية من جينات rol في عام واحد تقريبا. يمكن استخدام تحويل جذر الشعر القائم على الحقن في أنواع الكرنبيات الأخرى ، كما هو موضح من خلال تحويل Arabidopsis thaliana Col-0. بينما يستخدم hypocotyl لتحويل B. napus ، يتم حقن A. thaliana في جذع الإزهار الأساسي.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام والحلول
- تحضير حلول الأسهم الهرمونية.
- لتحضير 50 مل من محلول مخزون 1-نفثالين أسيتيك (NAA) و 6-بنزيلامينوبورين (BAP) وحمض الإندول -3-بيوتريك (IBA) بتركيز 5 مجم / مل ، قم بإذابة 250 مجم من الهرمون المسحوق في 2 مل من 1 M هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) واضبط الحجم على 50 مل بالماء عالي النقاء.
- لتحضير 50 مل من حمض الجبريليك (GA3) بتركيز 1 مجم / مل ، قم بإذابة 50 مجم من الهرمون المسحوق في 2 مل من الإيثانول واضبط الحجم على 50 مل من الماء عالي النقاء.
- قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة معقم بحجم مسام 0.22 ميكرومتر ووزعه في أنابيب معقمة سعة 2 مل للتخزين. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية ، حسب توصية الشركة المصنعة.
- تحضير حلول مخزون المضادات الحيوية. للحصول على 50 مل من محلول سيفوتاكسيم وتيكارسيلين ثنائي الصوديوم بتركيز 100 ملغ/مل، قم بإذابة 0.5 غرام من مسحوق المضادات الحيوية في 40 مل من الماء عالي النقاء واضبطه على الحجم النهائي البالغ 50 مل. قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة معقم بحجم مسام 0.22 ميكرومتر ووزعه في أنابيب معقمة سعة 2 مل للتخزين. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
ملاحظة: تضاف المضادات الحيوية والهرمونات دائما إلى الوسط المبرد. - تحضير 1 لتر من وسط مرق لوريا (LB) بإضافة 10 جم من باكتو تريبتون ، و 5 جم من مستخلص الخميرة ، و 5 جم من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) في أسطوانة قياس سعة 1 لتر واضبط الحجم على 1 لتر بالماء المقطر المزدوج. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 باستخدام KOH باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني (باتباع تعليمات الشركة المصنعة). نقل الحل إلى زجاجة 1 لتر وإضافة 15 غرام من أجار البكتريولوجية (1.5 ٪) ، إذا تم إعداد وسط صلب والأوتوكلاف الوسط. إذا لزم الأمر ، أضف المضادات الحيوية المناسبة (يتم تنفيذ المقاومة البكتيرية على المتجه الثنائي) إلى الوسط المبرد.
ملاحظة: استخدم الأوتوكلاف لتعقيم المحلول. ضع الزجاجة في السلة ، وأغلق الغطاء ، وقم بتعقيمها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية و 98.9 كيلو باسكال. يستخدم هذا البروتوكول دائما لحلول التعقيم في خطوات أخرى. - تحضير 1 لتر من خلاصة الخميرة لحم البقر (YEB) المتوسطة عن طريق خلط 5 غرام من مستخلص لحم البقر ، 1 غرام من خلاصة الخميرة ، 5 غرام من الببتون ، 5 غرام من السكروز ، و 0.5 غرام من كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) في الماء المقطر المزدوج. اضبط مستوى الصوت على 1 لتر. انقل المحلول إلى زجاجة سعة 1 لتر. الأوتوكلاف المتوسطة.
- تحضير 1 لتر من الوسط لإنبات البذور عن طريق خلط 2.2 غرام من مسحوق موراشيج وسكوج (MS) ، و 10 غرام من السكروز (1٪) ، و 0.5 غرام من أملاح الصوديوم 2- (N-Morpholino) حمض إيثان سلفونيك (MES) في الماء المقطر المزدوج. اضبط مستوى الصوت على 1 لتر ، وامزج ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.8 باستخدام KOH. نقل الحل إلى زجاجة 1 لتر وإضافة 8 غرام من أجار النبات (0.8 ٪). الأوتوكلاف المتوسطة.
- تحضير 1 لتر من وسط نمو النبات عن طريق خلط 2.2 غرام من مسحوق MS ، 5 غرام من السكروز (0.5 ٪) ، و 0.5 غرام من أملاح MES في الماء المقطر المزدوج. اضبط مستوى الصوت على 1 لتر ، وامزج ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.8 باستخدام KOH. انقل المحلول إلى زجاجة سعة 1 لتر وأضف 8 جم من أجار النبات (0.8٪). الأوتوكلاف المتوسطة.
- تحضير 1 لتر من وسط نمو الجذر المشعر عن طريق خلط 4.4 غرام من مسحوق الفيتامينات MS + B5 ، و 30 غرام من السكروز (3 ٪) ، و 0.5 غرام من أملاح MES في الماء المقطر المزدوج. اضبط مستوى الصوت على 1 لتر ، وامزج ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.8 باستخدام KOH ، وانقل المحلول إلى زجاجة سعة 1 لتر. أضف 3 غرام من عامل التبلور (0.3 ٪) والأوتوكلاف المتوسط. يضاف سيفوتاكسيم وتيكارسيلين ثنائي الصوديوم إلى تركيز نهائي قدره 100 - 200 ملغم / لتر و 100 - 500 ملغم / لتر ، على التوالي. إذا لزم الأمر ، أضف المضادات الحيوية المناسبة (المقاومة ناتجة عن T-DNA لناقل ثنائي).
- تحضير 1 لتر من وسط نمو النبات المركب عن طريق خلط 2.2 غرام من مسحوق الفيتامينات MS + B5 ، و 10 غرام من السكروز (1 ٪) ، و 0.5 غرام من أملاح MES في الماء المقطر المزدوج. اضبط مستوى الصوت على 1 لتر ، وامزج ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.8 باستخدام KOH وانقل المحلول إلى زجاجة سعة 1 لتر. أضف 6 غرام من عامل التبلور (0.6 ٪) والأوتوكلاف المتوسط. يضاف سيفوتاكسيم وتيكارسيلين ثنائي الصوديوم إلى تركيز نهائي قدره 200 ملغم/لتر و500 ملغم/لتر، على التوالي. إذا لزم الأمر ، أضف المضادات الحيوية المناسبة (المقاومة ناتجة عن T-DNA لناقل ثنائي).
- تحضير 1 لتر من وسط التجديد عن طريق خلط 4.4 غرام من مسحوق الفيتامينات MS + B5 ، 30 غرام من السكروز (3 ٪) ، و 0.5 غرام من أملاح MES في الماء المقطر المزدوج. اضبط مستوى الصوت على 1 لتر ، وامزج ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.8 باستخدام KOH. انقل المحلول إلى زجاجة سعة 1 لتر وأضف 3 جم من عامل التبلور (0.3٪). الأوتوكلاف المتوسطة. يضاف NAA و BAP إلى تركيز نهائي قدره 8 ملغم / لتر و 5 ملغم / لتر ، على التوالي ، وتيكارسيلين ثنائي الصوديوم إلى تركيز نهائي قدره 100 ملغ / لتر.
- تحضير 1 لتر من وسط استطالة تبادل لاطلاق النار عن طريق خلط 4.4 غرام من مسحوق الفيتامينات MS + B5 ، 20 غرام من السكروز (2 ٪) ، و 0.5 غرام من أملاح MES في الماء المقطر المزدوج. اضبط مستوى الصوت على 1 لتر ، وامزج ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.8 باستخدام KOH. انقل المحلول إلى زجاجة سعة 1 لتر وأضف 3 جم من أجار النبات (0.3٪). الأوتوكلاف المتوسطة. أضف BAP و GA3 إلى تركيز نهائي قدره 0.5 ملغم / لتر و 0.03 ملغم / لتر ، على التوالي ، وسيفوتاكسيم إلى تركيز نهائي قدره 100 ملغم / لتر.
- تحضير 1 لتر من وسط تحريض الجذر عن طريق خلط 2.2 غرام من مسحوق الفيتامينات MS + B5 ، و 10 غرام من السكروز (1 ٪) ، و 0.5 غرام من أملاح MES في الماء المقطر المزدوج. اضبط مستوى الصوت على 1 لتر ، وامزج ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.8 باستخدام KOH. نقل الحل إلى زجاجة 1 لتر وإضافة 3 غرام من عامل التبلور (0.3 ٪). الأوتوكلاف المتوسطة. أضف IBA وسيفوتاكسيم إلى تركيز نهائي قدره 0.5 ملغم / لتر و 100 ملغ / لتر ، على التوالي.
- تحضير 1 لتر من المخزن المؤقت لبروميد سيتيل ميثيل الأمونيوم (CTAB) بإضافة 20 جم من CTAB (2٪ وزن / v نهائي) ، 100 مل من 1M Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 (100 mM نهائي) ، 40 مل من 0.5 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0 (20 mM نهائي) ، 81.8 جم من كلوريد الصوديوم (1.4 M نهائي) و 5 جم من PVP40 (0.5٪ وزن / v نهائي). اضبط على 1 لتر بالماء المقطر المزدوج. الأوتوكلاف الحل. تخزين الحل لمدة تصل إلى 1 سنة في درجة حرارة الغرفة.
2. تحويل Agrobacterium مع ناقل ثنائي
- تحضير الحمض النووي لبلازميد ثنائي تم التحقق منه يحتوي على كاسيت T-DNA ليتم دمجه في جينوم النبات. تأكد من أن الحمض النووي البلازميد يحتوي على أملاح منخفضة لتجنب الشرر الكهربائي عند استخدام التثقيب الكهربائي. يوصى باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي البلازميد المختارة.
- تحضير خلايا Agrobacterium tumefaciens C58C1 ذات الكفاءة الكهربائية التي تحتوي على pRiA4b البلازميد المسبب للجذور المشعرة عن طريق تلقيح 200 مل من السائل المسخن مسبقا (28 درجة مئوية) YEB مع 8 مل من ثقافة ليلية طازجة. احتضان الاستزراع عند 28 درجة مئوية أثناء الاهتزاز حتى تكون الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) حوالي 0.5 ، المقابلة لمرحلة منتصف اللوغاريتم. يستغرق حوالي 4 - 5 ساعات.
- قسم مزرعة Agrobacterium إلى أربعة أنابيب طرد مركزي معقمة مسبقا سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 3200 × جم.
ملاحظة: يجب أن تبقى الخلايا باردة من هذه الخطوة فصاعدا. - قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات برفق في (4x) 2.5 مل من الجلسرين البارد (4 درجات مئوية) 10٪. أضف 47.5 مل أخرى من الجلسرين البارد 10٪ واخلطه برفق.
- خلايا الحبيبات عند 3200 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في (4x) 10 مل من الجلسرين البارد 10٪.
- قم بتكوير الخلايا مرة أخرى وأعد تعليقها في (4x) 0.75 مل من الجلسرين البارد 10٪. قم بتجميع محتوى الأنابيب الأربعة في أنبوب واحد (الحجم الكلي = 3 مل).
- قسم المحلول البكتيري الزراعي إلى 50 ميكرولتر من القسامات في أنابيب دقيقة معقمة سعة 1.5 مل مبردة مسبقا. قم بتجميد القسامات على الثلج الجاف أو النيتروجين السائل. قم بتخزين الأنابيب في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- ضع أنبوبا واحدا من الخلايا المختصة (50 ميكرولتر) على الجليد ، واخلطه مع 5 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد (1 ميكروغرام في المجموع ، من الخطوة 2.1) ، وانقل الخليط إلى كوفيت التثقيب الكهربائي (فجوة 0.2 سم) ، واحتضانه لمدة 5 دقائق على الجليد.
- ضع الكوفيت في جهاز الحفر الكهربائي وقم بالكهرباء الخلايا بالإعدادات التالية: السعة 25 μFD ، المقاومة 400 Ω ، الجهد الكهربائي 2.5 كيلو فولت ، مدة النبض 9.7 مللي ثانية.
- أضف 950 ميكرولتر من الوسط السائل LB إلى الخلايا ، والتي يتم استزراعها بعد ذلك عند 28 درجة مئوية لمدة 2 ساعة عند 300 دورة في الدقيقة في خلاط حراري. لوحة 50 ميكرولتر من زراعة الخلايا على وسط LB صلب مع المضادات الحيوية الانتقائية المناسبة. استزرع الأطباق لمدة يومين عند 28 درجة مئوية.
ملاحظة: يوصى بلوحة مجموعة من مزارع الخلايا (10 ميكرولتر - 100 ميكرولتر) لكل لوحة لتحديد حجم المزرعة المناسب وتجنب فرط نمو البكتيريا. - تحضير الثقافات السائلة من عدد قليل من المستعمرات المختارة في 5 مل من الوسط السائل LB مع المضادات الحيوية. تنمو البكتيريا بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية مع الهز. استخدم هذه الثقافات لمخزون الجلسرين عن طريق خلط 0.5 مل من ثقافة البكتيريا السائلة و 0.5 مل من 40٪ من الجلسرين.
ملاحظة: يتم التحقق من وجود هذه المستعمرات لوجود جين التحوير بواسطة مستعمرة PCR. لهذا الغرض ، أضف كمية صغيرة من مستعمرة من لوحة إلى المزيج الرئيسي PCR الذي يحتوي على المخزن المؤقت ، dNTP ، و Taq polymerase المفضل ، جنبا إلى جنب مع الاشعال التي تضخم جزءا من T-DNA من ناقل ثنائي. يستخدم اللقاح من مخزون الجلسرين لتحويل النباتات.
3. تحول الجذر المشعر لبراسيكا نابوس DH12075
- ضع بذور DH12075 براسيكا نابوس في أنابيب دقيقة وقم بتعقيمها في صندوق تدفق. أولا ، قم بإزالة الشحوم من البذور باستخدام الماء ومنظف 0.1٪ أثناء الهز لمدة 60 ثانية. ثم اشطف البذور بالماء متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وكلاهما لمدة 60 ثانية.
- تعقيم البذور باستخدام محلول 10 ٪ من التبييض التجاري الذي يحتوي على هيبوكلوريت الصوديوم. هز البذور في هذا الحل لمدة 20 دقيقة.
- اغسل البذور 4 مرات بالماء المعقم لمدة 60 ثانية لكل منهما. ضعها على أطباق بتري التي تحتوي على وسط إنبات البذور. قم بتقسيم البذور إلى طبقات على البارد عند 4 درجات مئوية طوال الليل وانقل الأطباق إلى غرفة الزراعة (21 درجة مئوية ، 16 ساعة فاتحة / 8 ساعات داكنة).
- انقل الشتلات البالغة من العمر 5 أيام إلى صناديق زراعة النباتات التي تحتوي على وسط نمو النبات.
ملاحظة: تم تحديد أفضل كفاءة تحويل في DH12075 للشتلات البالغة من العمر 18 يوما. يمكن تحسين عمر الشتلات لظروف النمو المحلية أو الأصناف الأخرى. - تلقيح مزرعة سائلة من Agrobacterium tumefaciens C58C1 تحمل بلازميد pRiA4b المشعر الذي يحفز الجذر والمتجه الثنائي للتحويل (من الخطوة 2.11) بحلقة تلقيح. استخدم 5 مل من وسط LB. قم بتنمية هذه الثقافة بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية حتى تصل إلى OD600 = 0.9 - 1.
ملاحظة: يتم استخدام Agrobacterium التي تحتوي فقط على بلازميد Ri إذا تم إنتاج جذور شعر من النوع البري. - حقن كمية صغيرة من الثقافة (حوالي 50 ميكرولتر) مع حقنة الأنسولين في hypocotyl من الشتلات البالغة من العمر 18 يوما (من الخطوة 3.4.). ثقب hypocotyl من خلال بإبرة 26G مثبتة على المحقنة على ارتفاع حوالي 1 سم فوق سطح الوسط. حقن السائل في الجرح. يمكن أيضا خدش الأنسجة الموجودة على سطح hypocotyl بواسطة المحقنة.
ملاحظة: يجب تكييف عدد الشتلات الملقحة مع احتياجات المجرب. - أعد النباتات إلى غرفة الزراعة عند 21 درجة مئوية لمدة 2 إلى 4 أسابيع حتى تتشكل جذور الكالس والشعر في موقع الجرح.
- قطع الكالس مع الجذور المشعرة الناشئة من hypocotyl ووضعه على طبق بتري مع وسط نمو الجذر المشعر الذي يحتوي على المضادات الحيوية الانتقائية (التي يحملها T-DNA) والسيفوتاكسيم (200 ملغ / لتر) والتيكارسيلين (500 ملغ / لتر) لقمع نمو البكتيريا الزراعية. ختم أطباق بتري بشريط نفاذية للغاز. استزرع الجذور المشعرة عند 24 درجة مئوية في الظلام.
ملاحظة: يجب اختبار التركيز المناسب للمضادات الحيوية المحددة المستخدمة في الاختيار الوظيفي مع جذور الشعر من النوع البري. بالنسبة ل B. napus DH12075 الجذور المشعرة التي تحمل مقاومة للكاناميسين ، يتم استخدام تركيز 25 مجم / لتر كاناميسين.
ملاحظة: في هذه الخطوة ، من الممكن إنشاء نبات مركب يتكون من الساق من النوع البري وجذور الشعر المعدلة وراثيا التي تدعم نمو هذا النبات. بدلا من قطع الجذور المشعرة من الساق ، تتم إزالة الجذور الأصلية للنبات. يتم نقل النبات ذو الجذور المشعرة الناشئة إلى صندوق زراعة نباتية مع وسط نمو نباتي مركب يحتوي على سيفوتاكسيم (200 مجم / لتر) وتيكارسيلين (500 مجم / لتر) لقمع نمو البكتيريا الزراعية ، والمضاد الحيوي الانتقائي (الذي يحمله T-DNA). - بعد 1-2 أسابيع ، اعزل الجذور المشعرة على طبق بتري من الكالس وقم بتخصيصها على أطباق بنفس وسيط الثقافة. انقل الثقافة إلى طبق جديد كل 4 إلى 5 أسابيع. أضف 0.25 مجم / لتر IBA لزيادة تفرع الجذر.
- تقليل تركيزات سيفوتاكسيم وتيكارسيلين تدريجيا عند كل عملية نقل بمقدار 100 ملغم/لتر (أي أن الوسط الخاص بالنقل الأول يحتوي على 100 ملغم/لتر سيفوتاكسيم و400 ملغم/لتر تيكارسيلين؛ بالنسبة للنقل الثاني، 300 ملغم/لتر تيكارسيلين، إلخ). بعد 3 - 4 أشهر، يتم زراعة الجذور المشعرة على وسط نمو الجذور المشعرة باستخدام 100 ملغ/لتر تيكارسيلين والمضاد الحيوي الانتقائي.
4. تجديد براسيكا نابوس DH12075 جذور شعر
- انقل خطوط الجذر المشعرة المستقلة إلى ألواح ذات وسط تجديد في ظروف معقمة باستخدام ملاقط ملتهبة قبل الاستخدام. انقل 5-10 جذور لكل طبق بتري واستزرعها عند 21 درجة مئوية في فترة ضوئية طويلة (16 ساعة فاتحة / 8 ساعات داكنة). ختم أطباق بتري بشريط نفاذية للغاز.
- كل 3 إلى 4 أسابيع ، انقل الجذور المشعرة إلى أطباق ذات وسط تجديد جديد. لاحظ أن كالي تتشكل بعد حوالي 2 أسابيع. الكالس يبدأ اطلاق النار بعد 2 أسابيع أخرى حتى 8 - 9 أسابيع بعد تشكيل الكالس.
- قم بتخصيص البراعم ونقلها إلى صناديق زراعة النباتات باستخدام وسيط استطالة البراعم لمدة 2 إلى 3 أسابيع لتعزيز استطالة البراعم.
- انقل البراعم الممدودة إلى صناديق زراعة النباتات باستخدام وسيط تحريض الجذر. تحديث الثقافة كل 3 - 4 أسابيع. تبلغ كفاءة التجذير في DH12075 87٪ في 30 يوما وتصل إلى 100٪ بعد 60 يوما.
- انقل النباتات ذات الجذور إلى التربة بعد إزالة أي آثار لعامل التبلور لمنع العدوى الفطرية. تأكد من تأقلم النباتات أولا في phytotrons (21 درجة مئوية ، فترة ضوئية طويلة ، 150 μE) ثم نقلها إلى دفيئة للإزهار (21 درجة مئوية / 18 درجة مئوية ، فترة ضوئية طويلة ، 150 μE).
5. اختيار نبات التجديد و T1
ملاحظة: يمكن اختيار خطوط الجذر المشعرة قبل الدخول في عملية التجديد. يعتمد نوع الاختيار على المحتوى الذي يحمله جين التحوير. يمكن أخذ عينات من الجذور المشعرة لاستخراج الحمض النووي والتنميط الجيني أو اكتشاف الطفرات ، واستخراج الحمض النووي الريبي مع تخليق cDNA اللاحق و RT-qPCR لتحليل مستوى التعبير للجين المختار ، والفحص المجهري للكشف عن التألق ، أو معالجته من تلطيخ GUS.
- بعد النقل إلى التربة ، قم بالتركيب الوراثي للنباتات المتجددة T0 (وشتلات T1) مرة أخرى لتجنب الهروب من إجراءات الاختيار. تظهر نباتات T0 نمطا ظاهريا متغيرا يسمى النمط الظاهري Ri: نمو جذري واسع النطاق ، وأوراق مجعدة ، وبراعم قزم ناتجة عن وجود TL و / أو TR-DNA لبلازميد Ri الذي تم إدخاله في جينوم النبات.
- لتسريع اختيار T1 ، استخدم البذور التي تحتوي على أجنة خضراء ناضجة (حوالي 21 - 28 يوما بعد التلقيح لمدة DH12075 لجنين طوربيد أو أكبر) من نباتات تجديد T0 لإنقاذ الأجنة.
- العمل في مربع التدفق المعقم. جمع السيليكات وتعقيمها السطحية مع 70 ٪ من الإيثانول.
- ضعها على شريط على الوجهين مثبت على غطاء لوحة أو شريحة.
- باستخدام مجهر ستيريو ، قم بشق السيليك على طول هوامش الصمام باستخدام إبرة 26G. تأكد من أن القطع لا يتلف البذور. لسهولة الإمساك ، قم بتركيب الإبرة على حقنة سعة 1 مل.
- افتح الكاربيل وألصقها بالشريط. جمع البذور غير الناضجة ونقلها إلى لوحات مع متوسطة لإنبات البذور. ختم الألواح بشريط نفاذية للغاز.
- ضع الأطباق في غرفة زراعة (21 درجة مئوية ، 16 ساعة فاتحة / 8 ساعات داكنة) حتى الإنبات.
- النمط الوراثي لشتلات T1 لوجود جين التحوير محل الاهتمام وغياب Ri TR / TL (الشكل 1). جمع المواد ورقة واستخراج الحمض النووي باستخدام الطريقة التي تختارها. يتم وصف أسلوب CTAB هنا:
- اجمع مادة الأوراق في أنبوب دقيق سعة 2 مل يحتوي على حبتين خزفيتين. تجميد الأنبوب في النيتروجين السائل.
- طحن المواد باستخدام مطحنة الكرة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام المدقة وقذائف الهاون.
- بعد الدوران السريع لأسفل ، أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت CTAB إلى المسحوق. دوامة لفترة وجيزة ، تدور لأسفل ، واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة على الأقل.
- تبريد الحل لدرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف حجما واحدا من الكلوروفورم واخلطه بلطف.
تنبيه: عند استخدام الكلوروفورم ، اعمل تحت التدفق الكيميائي واستخدم القفازات للحماية. يجب التخلص من أي محلول يحتوي على الكلوروفورم في سلة المهملات المناسبة. - جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 18400 × جم باستخدام جهاز طرد مركزي منضدي. نقل 250 - 350 ميكرولتر من المرحلة المائية العليا إلى أنبوب دقيق جديد. حذف الطور البيني.
- أضف حجما واحدا من الأيزوبروبانول ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي لمدة 40 دقيقة عند 18400 × جم.
- تخلص من السائل وأضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. اغسل الحبيبات وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 18400 × جرام.
- تخلص من السائل. جفف الحبيبات في الهواء وأضف 50-100 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. دع الحمض النووي يذوب لمدة 1 ساعة حتى يتنقل طوال الليل في الثلاجة.
- إجراء التنميط الجيني بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لجين rolA (TL) وجين aux1 (TR) وموضع virC (Agrobacterium). قم بإعداد تفاعل PCR باستخدام الحمض النووي المحضر (من الخطوة 5.3.) ، والبادئات ، والمخزن المؤقت ، و dNTP ، و Taq polymerase وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. يبلغ طول الأجزاء المضخمة 200 - 500 نقطة أساس.
الاشعال محددة لرولا:
إلى الأمام: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG
عكس: TGCGTATTAATCCCGTAGGTC
الاشعال الخاصة ب aux1:
خط الهجوم: كاتاغاتكجكتكاكاجت
عكس: CGTTGCTTGATGTCAGGAGA
الاشعال محددة ل virC:
مهاجم: AATGCGTCTCTCTCGTGCAT
عكس: AAACCGACTAACGCGAT
ملاحظة: قد يكون نقل T-DNA وتكامله جزئيا ، وقد تندمج أجزاء فقط من TL و / أو TR في الجينوم. وبالتالي ، يوصى بتحليل وجود ORFs أخرى من TL (على سبيل المثال ، rolB و rolC) و TR (aux2 ، mas1 ، ags1) في شتلات T1. يتم سرد تسلسلات التمهيدي الخاصة بهذه المواضع في Jedličková et al.9. - تقييم تفاعلات PCR عن طريق هلام الكهربائي.
ملاحظة: يوصى بتضمين عنصر تحكم إيجابي في هذا التحليل لضمان وجود حمض نووي بدرجة تفاعل البوليميراز المتسلسل. - حدد لوجود (أو غياب) جين التحوير وفقا للبروتوكولات القائمة على محتوى هذا التحوير.
- نقل الشتلات المختارة إلى التربة.
6. تحويل جذور الشعر وتجديدها في أرابيدوبسيس ثاليانا كول-0
- تعقيم بذور A. thaliana بطريقة مختارة (التبييض أو الإيثانول أو غاز الكلور).
- لوحة البذور المعقمة على وسط لإنبات البذور. بعد يومين من التقسيم الطبقي البارد ، انقل الألواح إلى غرفة الزراعة (21 درجة مئوية مع فترة ضوئية طويلة ورطوبة 50٪).
- نقل الشتلات البالغة من العمر 1 أسبوع إلى صندوق زراعة النبات مع وسط نمو النبات.
- تحضير مزارع Agrobacterium كما هو موضح في الخطوة 3.5.
- حقن كمية صغيرة من المستنبتة (حوالي 50 ميكرولتر) بإبرة مثبتة على حقنة أنسولين في قاعدة جذع الإزهار الأساسي (حوالي 1-2 سم فوق الوردة) من نباتات أرابيدوبسيس البالغة من العمر شهرا واحدا. يمكن أيضا خدش الأنسجة الموجودة على سطح الجذع الأساسي بواسطة المحقنة.
- في 2-4 أسابيع بعد الحقن ، قم باستئصال الجذور المشعرة الناشئة وزرعها على أطباق بتري مع وسط نمو الجذر المشعر المكمل بالمضادات الحيوية الانتقائية (التي يحملها T-DNA) والسيفوتاكسيم (200 مجم / لتر) والتيكارسيلين (500 مجم / لتر) لقمع نمو البكتيريا الزراعية. احتضان الأطباق عند 24 درجة مئوية في الظلام.
- بعد 1-2 أسابيع ، قم بتخصيص الجذور المشعرة على أطباق بنفس وسط الثقافة. انقل خطوط الجذر المشعرة المحددة إلى وسط جديد كل 4 - 5 أسابيع.
ملاحظة: جذور A. thaliana المشعرة أرق من جذور B. napus ، ويجب توخي الحذر عند الانتقال إلى وسائط جديدة. - انقل الجذور المشعرة إلى أطباق ذات وسط تجديد للحث على تكوين الكالس. استزرع الألواح عند 21 درجة مئوية في فترة ضوئية طويلة (16 ساعة فاتحة / 8 ساعات مظلمة).
- براعم تخرج من الكالس بعد 18 - 21 يوما من الزراعة. قطع البراعم ونقلها إلى وسط استطالة تبادل لاطلاق النار لمدة 2-3 أسابيع لتعزيز النمو والاستطالة.
- نقل البراعم الممدودة إلى وسط تحريض الجذر.
- نقل النباتات الجذور إلى التربة. تقدم نباتات T0 أيضا النمط الظاهري Ri. قم بإجراء الانتقاء المعدل وراثيا ، كما هو موضح ل B. napus DH12075 (الخطوة 5).
Representative Results
لقد قمنا سابقا بتحسين بروتوكول لتحريض جذور الشعر القائم على الحقن في ثلاثة أصناف من براسيكا نابوس ، وهي DH12075 و Topas DH4079 و Westar9. لتطبيق بروتوكول التحول هذا على النوع النموذجي A. thaliana ، تم حقن سيقان الإزهار الأولية للنباتات البالغة من العمر 1 شهرا بلقاح زراعي. ظهرت جذور الشعر في موقع الحقن بعد 2-4 أسابيع. تم استئصال الجذور المشعرة وزراعتها على الوسط الصلب. يوضح الشكل 1 مقارنة الطريقة في هذين النوعين.
تم نقل خطوط جذر مشعرة مختارة إلى وسط التجديد للحث على تكوين الساق. في A. thaliana ، تم تحفيز كالي أصفر في غضون 14 يوما في جميع خطوط الجذر المشعرة العشرة التي تم اختبارها. ظهرت أول لقطة أولية مرئية كبقع خضراء داكنة في غضون 3 أسابيع بعد نقلها إلى وسط التجديد (الشكل 2). بعد 4 أسابيع من الثقافة ، غطت البراعم الجذور المشعرة في 9 من 10 خطوط جذر مشعرة (كفاءة تجديد 90٪). في بعض الحالات ، تم استنباط الجذور المغامرة من الكالس (الشكل 2H). لم يتجدد خط واحد حتى بعد 3 أشهر على وسط التجديد (كل 4 أسابيع ، تم نقل جذور الشعر إلى وسط جديد). وبالتالي ، فإن كفاءة تجديد جذور A. thaliana المشعرة تشبه كفاءة B. napus DH12075 9.
تعرض مجددات الجذور المشعرة ل B. napus و A. thaliana نمطا ظاهريا قزما (الشكل 3) ، وهي سمة نموذجية للنباتات المشتقة من الجذورالمشعرة 2. لاحظنا أيضا أنظمة الجذر الكثيفة والأوراق المجعدة والتغيرات في وقت الإزهار. هذا النمط الظاهري المزعوم للجذر المشعر (أو Ri) ناتج عن جينات rol من بلازميد Ri التي يتم إدخالها في جينوم النبات. قد يكون إدخال Ri T-DNA وجين التحوير المشفر على ناقل ثنائي مستقلا أو مرتبطا. وبالتالي ، فإن تحليل الفصل لذرية T1 الناتجة عن التلقيح الذاتي يساعد على تحديد النباتات الخالية من الرول التي تعبر عن الجينات المحورة محل الاهتمام. يتم إجراء التنميط الجيني لنباتات T1 بواسطة بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة ب ORFs من TL و TR والجينات المحورة ذات الأهمية. يتم التحقق من عدم وجود تلوث زراعي من خلال عدم وجود منتجات PCR من الاشعال virC (الشكل 1).
الشكل 1: ملخص الإجراء في A. thaliana و B. napus. يؤدي حقن لقاح Agrobacterium في جذع hypocotyl أو الإزهار الأولي إلى تطور جذور الشعر. يمكن أن تحل الجذور المشعرة محل الجذور الأصلية لتوليد نبات مركب سيتم تنميطه وراثيا وتحليله (الأسهم الزرقاء). يمكن تجديد الجذور المشعرة المستزرعة إلى نباتات T0 ، ونشرها في نباتات T1 ، والنمط الوراثي (الأسهم الخضراء). يمكن أيضا زراعة الجذور المشعرة للتحليل الوظيفي (السهم الأسود). يتم تقديم أمثلة على نتائج التنميط الجيني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجديد الجذور المشعرة في A. thaliana. (أ) ثقافة الجذر المشعر 1 يوم بعد نقله إلى اللوحات. (ب، ج) وضعت كالي في غضون 2 أسابيع من الثقافة على وسط التجديد. (د، ه) ظهرت تبادل لاطلاق النار primordia بعد 3 أسابيع من الثقافة. (ز ، ح) تتشكل البراعم بعد 4 أسابيع. (ح) الجذور العرضية التي تطورت من الكالس. (ج، و، ط) خط جذر شعر غير متجدد. تمثل قضبان المقياس 1 سم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: صور تمثيلية لنباتات B. napus و A. thaliana البرية ومواد التجديد المشتقة من الجذور المشعرة (نباتات T0). لاحظ النمط الظاهري Ri للمجددات. تمثل قضبان المقياس 2 سم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Discussion
قمنا بتطوير بروتوكول بسيط لتحويل جذر الشعر والتجديد اللاحق في B. napus و A. thaliana. تتضمن هذه العملية تحريض جذر الشعر القائم على الحقن في hypocotyl (B. napus) أو جذع الإزهار الأولي (A. thaliana). كانت طريقة حقن hypocotyl مع سلالة البكتيريا الزراعية C58C1 التي تحمل بلازميد Ri فعالة أيضا في عائلة Fabaceae10,11 ، إلى جانب أعضاء Brassicaceae المقدمة في هذه الدراسة.
بديل للطريقة القائمة على الحقن هو التحول القائم على الغمر الذي يتكون من غمر النبات في تعليق بكتيري ، يليه الزراعة المشتركة للزرع مع البكتيريا الزراعية. تتمثل ميزة الطريقة القائمة على الحقن على طريقة الغمر في الوقت الذي يتم توفيره بسبب عدم وجود بعض خطوات البروتوكول: تحضير الزرع ، واختبار وقت الزراعة المشتركة ، والثقافة على وسط يحتوي على هرمون لتحريض الجذور المشعرة. على الرغم من أن كلا النهجين فعالان في تحريض جذر الشعر ، فقد لوحظت كفاءة تحويل أعلى في بعض الأنواع بالطريقة القائمة على الحقن مقارنة بغمر النبات12,13. علاوة على ذلك ، فإن التحول القائم على الحقن مفيد أيضا لتوليد النباتات المركبة (جذور الشعر المعدلة وراثيا والبراعم البرية). بعد قطع الجذور الأصلية للنبات المحول ، تدعم الجذور المشعرة نمو النبات ، ويمكن دراسة جين التحوير في سياق النبات بأكمله.
الخطوة الحاسمة لتحريض جذر الشعر هي حقن اللقاح في hypocotyl ، أو جذع الإزهار الأولي. إن hypocotyls من B. napus قابلة للكسر ، ويمكن أن يحدث قطع hypocotyl كله بسهولة. يمكن ملاحظة الشيء نفسه مع A. thaliana بسبب نحافة جذع الإزهار. إذا كانت هناك حاجة إلى مقارنة كفاءة التحول بين الأنواع / الأصناف المختلفة ، فإننا نوصي بأن يقوم شخص واحد بإجراء جميع التجارب لتجنب الخطأ الناجم عن التلاعب والمهارة في حقن النباتات.
قمنا بتطوير بروتوكول فعال لتجديد جذور الشعر في B. napus DH12075 و A. thaliana Col-0. نظرا لأن التجديد عملية متغيرة للغاية ، فقد يتم تطبيق بعض تعديلات البروتوكول على نوع أو صنف من اختياره. على سبيل المثال ، يمكن استنباط البراعم المشتقة من الجذور المشعرة بنسبة أوكسين / سيتوكينين مختلفة (1: 1) في B. oleracea14. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام السيتوكينين ثيديازورون بدلا من BAP ، كما هو الحال في جذور B. campestris المشعرة15.
تمثل عمليات الإدراج المتعددة ل Ri plasmid T-DNA في جينوم النبات قيودا محتملة على نظام تحويل وتجديد جذر الشعر. في مثل هذه الحالات ، لا يتم الكشف عن أي نباتات خالية من TL / TR من بلازميد Ri بعد تحليل فصل شتلات T1. وبالتالي ، نوصي بتوليد العديد من خطوط الجذر المشعرة المستقلة لكل جين محور.
تعتبر مزارع الجذور المشعرة أداة قوية للغاية للدراسات الوظيفية الجينية ويرجع ذلك أساسا إلى إنشائها السريع وصيانتها الرخيصة (لا حاجة للهرمونات في وسائط الزراعة). يغطي هذا البروتوكول طرق تحريض الجذور المشعرة وتجديدها في B. napus و A. thaliana ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الجينات المحورة ذات الأهمية مباشرة في مزارع الجذور المشعرة ، في سياق النبات بأكمله باستخدام النباتات المركبة ، أو بعد تجديد النباتات المحورة وراثيا.
Disclosures
يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري دون أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
نعترف ب Jiří Macas (مركز الأحياء CAS ، České Budějovice ، جمهورية التشيك) لتوفير سلالة البكتيريا الزراعية. تم الاعتراف بعلوم نباتات المرافق الأساسية في CEITEC MU لدعمها الفني. ودعمت هذا العمل وزارة التعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية مع الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية - مشروع "SINGING PLANT" (رقم. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) والمشروع بين التكاليف LTC20004.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.50 mL tubes | Eppendorf | 125.215 | |
| 10% solution of commercial bleach | SAVO | ||
| 1-naphthaleneacetic acid (NAA) | Duchefa | N0903 | Callus regeneration medium |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 108.132/108.078 | |
| 3M micropore tape | Micropore | ||
| 6-Benzylaminopurine (BAP) | Duchefa | B0904 | Callus regeneration medium, Shoot elongation medium |
| 70% ethanol | |||
| bacteriological agar | HiMedia | RM201 | LB medium |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | LB and YEB media |
| Beef extract | Roth | X975.1 | YEB medium |
| Bottles | DURAN | L300025 | |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| chloroform | Serva | 3955301 | |
| CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma | 52365 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | R0193 | |
| EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma | ES134-250G | |
| elctroporation cuvette | |||
| electrophesis agar, peqGOLD universal | VWR | 732-2789 | |
| electrophoresis chamber | BIO-RAD | ||
| electrophoresis gel reader | BIO-RAD | ||
| electroporator GenePulser Xcell | BIO-RAD | ||
| ethidium bromide | AppliChem | ||
| Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap | BIO-RAD | 1652082 | |
| Gene Ruler DNA ladder mix | Thermo Fisher Scientific | SM0331 | |
| Gibberellic acid (GA3) | Duchefa | G0907 | Shoot elongation medium |
| glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique | Merck | 1101100250 | |
| indole-3-butyric acid (IBA) | Duchefa | I0902 | Root induction medium |
| kanamycin monosulfate | Duchefa | K0126 | |
| Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid | Plant Media | V8505-100 | |
| Measuring cylinder | |||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) | Duchefa | M0237 | Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins | Duchefa | M0231 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm | Terumo | ||
| pH meter | |||
| Phytagel | Sigma | P8169 | Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination |
| PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000) | Sigma | 9003-39-8 | |
| Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included | Sigma | D4309-250UN | |
| Retsh mill | Qiagen | ||
| sodium chloride | Lachner | 30093-APO | LB medium |
| square Petri Dishes | Corning | GOSSBP124-05 | |
| sucrose | Penta | 24970-31000 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Syringe filter | Carl Roth | P666.1 | Rotylabo syringe filters 0.22 µm pore size |
| thermomixer | Eppendorf | ||
| Ticarcillin disodium | Duchefa | T0180 | Hairy root growing medium |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethan | Serva | 3719003 | |
| ultrapure water | Millipore Milli-Q purified water | ||
| Yeast extract | Duchefa | Y1333 | LB medium |
References
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Christey, M. C. Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures—a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean. Plants. 11 (8), 1044 (2022).
- Petit, A., et al. Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation. Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).
- Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops. Crop improvement. , Springer. Boston, MA. (2013).
- Jedličková, V., et al. Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus). Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).
- Steinbauerová, V., Neumann, P., Macas, J. Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).
- Neumann, P., et al. Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species. Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).
- Montazeri, M., et al. A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum. Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).
- Zhang, X., et al. Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response. Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K. Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation. Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation. Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).
