Summary
מענה לצרכים דחופים לאבחון דנגי, כאן אנו מציגים מכשיר אנליטי מבוסס נייר דנגי NS1 משולב באפליקציית סמארטפון (DEN-NS1-PAD) לכימות ריכוז האנטיגן של דנגי NS1 בדגימות סרום / דם קליניות. חדשנות זו משפרת את ניהול הדנגה על ידי סיוע בקבלת החלטות קליניות במסגרות בריאות שונות, אפילו מוגבלות במשאבים.
Abstract
זיהום בנגיף דנגי (DENV), המועבר על ידי יתושי אדס , הוא דאגה מרכזית לבריאות הציבור במדינות טרופיות וסובטרופיות. עם שכיחות שנתית של כ-10 מיליון מקרים ו-20,000-25,000 מקרי מוות, במיוחד בקרב ילדים, יש צורך דחוף בכלי אבחון מעשיים. נוכחותו של חלבון לא מבני של דנגי 1 (NS1) במהלך זיהום מוקדם נקשרה לשחרור ציטוקינים, דליפת כלי דם ותפקוד לקוי של האנדותל, מה שהופך אותו לסמן פוטנציאלי לדנגה חמורה.
בדיקות חיסוניות מבוססות נייר כגון מבחני זרימה לרוחב (LFAs) והתקנים אנליטיים מבוססי נייר מיקרופלואידים (PADs) צברו פופולריות כבדיקות אבחון בשל פשטותן, מהירותן, זולותן, ספציפיות וקלות הפרשנות שלהן. עם זאת, בדיקות חיסוניות קונבנציונליות מבוססות נייר לזיהוי דנגי NS1 מסתמכות בדרך כלל על בדיקה חזותית, ומניבות תוצאות איכותיות בלבד. כדי להתמודד עם מגבלה זו ולשפר את הרגישות, הצענו בדיקת זיהוי דנגי NS1 ניידת ביותר במכשיר אנליטי מבוסס נייר (PAD), כלומר, DEN-NS1-PAD, המשלב יישום סמארטפון כקורא צבעוני וכמותי. מערכת הפיתוח מאפשרת כימות ישיר של ריכוזי NS1 בדגימות קליניות.
דגימות סרום ודם שהתקבלו מחולים שימשו להדגמת ביצועי אב הטיפוס של המערכת. התוצאות התקבלו באופן מיידי וניתן להשתמש בהן להערכה קלינית, הן במתקני בריאות מאובזרים היטב והן במסגרות מוגבלות במשאבים. שילוב חדשני זה של בדיקה חיסונית מבוססת נייר עם יישום טלפון חכם מציע גישה מבטיחה לזיהוי וכימות משופרים של אנטיגן דנגי NS1. על ידי הגברת הרגישות מעבר ליכולות של עין בלתי, מערכת זו טומנת בחובה פוטנציאל גדול לשיפור קבלת ההחלטות הקליניות בניהול דנגי, במיוחד באזורים מרוחקים או מוחלשים.
Introduction
זיהום בנגיף דנגי (DENV) הוא המחלה המועברת על ידי יתושים המתפשטת במהירות הגבוהה ביותר1, ויותר מ -390 מיליון אנשים נגועים ב -96 מיליון זיהומים סימפטומטיים, 2 מיליון מקרים של מחלה קשה, ויותר מ -25,000 מקרי מוות בשנה מתרחשים בעולם 1,2. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), כ -3.9 מיליארד אנשים נמצאים בסיכון לדנגה; ~70% חיים במדינות אסיה פסיפיק ובעיקר בדרום מזרח אסיה3. בשנת 2019, מספר מקרי הדנגה שדווחו לארגון הבריאות העולמי היה 4.2 מיליון, ותאילנד תרמה לפחות 136,000 מקרי דנגי ו -144 מקרי מוות מזיהום דנגי4. התפרצות הדנגה בתאילנד מתרחשת בעונה הגשומה, מאפריל עד דצמבר, באזורים עירוניים וכפריים כאחד, במיוחד באזור הצפון-מזרחי.
לזיהומים ב- DENV יש ביטויים קליניים שונים החל מתסמינים תת-קליניים, קדחת דנגי קלה (DF) ועד קדחת דימומית חמורה של דנגה (DHF). המאפיין העיקרי של מצב DHF חמור הוא חדירות כלי דם מוגברת ואחריה הלם ותפקוד לקוי של איברים1. הבנת המסלול המולקולרי שיכול לגרום לדליפת כלי הדם חשובה מאוד בפיתוח טיפולי דנגי יעילים. דנגי חלבון לא מבני 1 (NS1) הוא גליקופרוטאין מופרש במהלך זיהום מוקדםבנגיף 5,6, והוא מתפקד כקופקטור לשכפול RNA נגיפי7. NS1 יכול לגרום לשחרור ציטוקינים ולתרום לדליפה וסקולרית על ידי קשירה לקולטן דמוי אגרה 4 (TLR4) וגליקוקליקסאנדותל 8,9. מחקרי מבחנה הראו כי NS1 מקיים אינטראקציה עם תאי אנדותל וגורם לאפופטוזיס. מצב זה יכול לתרום לתפקוד לקוי של האנדותל ולדליפת כלי דם10. רמות האנטיגן NS1, בקורלציה עם רמות אינטרלוקין בסרום (IL)-10, עלו באופן משמעותי בחולים עם מחלה קלינית קשה11. דנגי NS1 תורם גם לפתוגנזה של מחלות על ידי גרימת IL-10 ודיכוי תגובות תאי T ספציפיות ל- DENV12,13. בנוסף, חלבון דנגי NS1 היה קשור למחלה קלינית קשה, והריכוז של NS1 > 600 ng mL-1 בשלושת הימים הראשונים של המחלה היה קשור להתפתחות של DHF14.
ההתמדה של אנטיגן דנגי NS1 בחולים עם DHF יכול לשמש סמן של דנגיחמור 6. ישנן מספר שיטות לזיהוי NS1 בדגימות קליניות כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) והבדיקה המהירה15. תקן הזהב למדידת ריכוז חלבוני NS1 במסגרת קלינית הוא שיטת ELISA. עם זאת, שיטת ELISA היא יקרה ודורשת כוח אדם מיומן, ומתקני מעבדה16. לכן, פיתוח הטכנולוגיה לגילוי וכימות חלבוני NS1 במבחן נקודת הטיפול (POCT) עדיין נמשך. בעשור האחרון, בדיקות חיסוניות מבוססות נייר כגון מבחני זרימה צידית (LFAs) והתקנים אנליטיים מבוססי נייר מיקרופלואידים (μPADs) הפכו פופולריים כבדיקות אבחון בגלל הפשטות, המהירות, הזולות והספציפיות שלהם 17,18,19. במערכת חיסונית מבוססת נייר, מספר תוויות שימשו ליצירת אותות, כגון ננו-חלקיקי זהב (AuNPs)20, ננו-חלקיקים מגנטיים21,22, נקודות קוונטיות23 וחומרים פלואורסצנטיים24,25. AuNPs הן התוויות הנפוצות ביותר המשמשות בבדיקות חיסוניות מבוססות נייר בשל עלות הייצור הזולה שלהן, קלות הייצור, היציבות והקריאה הפשוטה שלהן. נכון לעכשיו, בדיקות זרימה לרוחב (LFAs) עבור דנגי NS1 משמשים המפורסם בסביבה הקלינית26,27. עם זאת, זיהוי תוויות LFA קונבנציונלי משתמש בדרך כלל בעין בלתי ומספק רק תוצאות איכותיות.
בעשור האחרון, יותר מ -5 מיליארד טלפונים חכמים היו בשימוש נרחב ברחבי העולם, ויש פוטנציאל לפיתוח זיהוי נייד28,29. לסמארטפונים יש יכולות רב-תכליתיות כגון חיישנים פיזיים מובנים, מעבדים מרובי ליבות, מצלמות דיגיטליות, יציאות USB, יציאות שמע, אלחוט ותוכנות יישומים, מה שהופך אותם למתאימים לשימוש בפלטפורמות ביו-חיישנים שונות30. בנוסף, טכנולוגיות אלחוטיות מאפשרות שליחת נתונים במהירות וניתן להשתמש בהן לניטור בזמן אמת ובאתר הלקוח31. Mudanyali et al. שילבו את החיסון מבוסס הנייר ואת הסמארטפונים כדי לפתח פלטפורמת POCT ניידת, ללא ציוד, מהירה, בעלות נמוכה וידידותית למשתמש עבור מלריה, שחפת ו- HIV32. לינג ועמיתיו דיווחו על בדיקת זרימה רוחבית בשילוב עם מצלמת סמארטפון כדי לזהות פעילות פוספטאז אלקליין בחלב באופן כמותי33. Hou et al. פיתחו גם מערכת הדמיה דו-מודאלית מבוססת סמארטפון עבור אותות כמותיים מצבע או פלואורסצנטיות בבדיקת הזרימה הצידית34. בנוסף, שימוש בסמארטפון כקורא קולורימטרי וכמותי יכול לשפר את הרגישות בעוד שהעין הבלתי אינה יכולה לדווח בביטחון על נוכחות המטרה35.
מציג פריצת דרך באבחון דנגי, DEN-NS1-PAD 36,37,38 (המכונה המכשיר להלן) מציע פתרון נייד ויעיל. באמצעות טכנולוגיה מבוססת נייר מיקרופלואידי המודפס בשעווה, התקן זה מכמת את NS1 עם רגישות גבוהה וספציפיות באמצעות עיבוד תמונה. כדי לשפר עוד יותר את השירות שלה, פיתחנו אפליקציית סמארטפון ידידותית למשתמש לקריאה צבעונית וכמותית. תיקוף קליני באמצעות דגימות מטופלים מבתי חולים תאילנדיים מדגיש את השפעתו המיידית על הערכת המטופלים בזמן אמת. החדשנות שלנו מסמנת התקדמות מרכזית בניהול יעיל של נקודות טיפול, ומבטיחה לחולל מהפכה בתחום האבחון בנופים של שירותי בריאות מוגבלים במשאבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ועדת האתיקה של ועדת הביקורת המוסדית, המחלקה הרפואית של הצבא המלכותי התאילנדי, בית החולים Phramongkutklao, בנגקוק, תאילנד (IRBRTA 1218/2562) נתנה אישור. בביצוע מחקר זה, עמדנו בכל התקנות האתיות הדרושות.
1. ייצור מכשיר של Immunoassay מבוסס נייר
הערה: מכשיר החיסון מבוסס הנייר יוצר על פי שיטותשנקבעו בעבר 36,37, ובקשת פטנט תאילנדית מס '19010081638.
- עיצוב ושרטוט תבניות: עצבו את המכשיר האנליטי מנייר (איור 1A,B) עם 18 תבניות שעווה של PAD במחשב.
הערה: העיצוב ספציפי ומיועד לנייר בגודל A5. מספר PADs קשור לגודל הנייר, כפי שהמשתמש דורש. - הדפס את התבנית המעוצבת על נייר התאית באמצעות מדפסת שעווה (Table of Materials).
- המיסו את הנייר המודפס בשעווה בתנור מעבדה למשך 75 שניות ב-150°C. לאחר מכן, אחסנו אותו בקופסת סיליקה עד שיהיה צורך בשלבים הבאים.
- יש למרוח 0.5 μL של 0.025% פולי-L-ליזין (PLL) הן על אזורי הבדיקה והן על אזורי הבקרה. דוגרים בטמפרטורת החדר (RT) במשך 2 דקות בקופסת סיליקה ולאחר מכן מחממים בתנור ב-65°C למשך 5 דקות.
- יש למרוח 0.5 μL של 1 מיקרוגרם μL-1 של נוגדן IgG נגד עכבר עיזים על אזור הבקרה ו-0.5 μL של 1 מיקרוגרם μL-1 של נוגדן הלכידה על אזור הבדיקה. הניחו לטיפות להתייבש בקופסת ג'ל סיליקה ב-RT למשך 30 דקות.
- יש למרוח 2 μL של המאגר החוסם על אזור הדגימה, 3 μL על האזור המצומד ו-2 μL על אזור האיתור. הניחו לטיפות להתייבש ב-RT בקופסת ג'ל סיליקה למשך 30 דקות.
- יש למרוח 2 μL של תמיסת ננו-חלקיקים-נוגדנים מוזהבים (AuNPs-Ab) על האזור המצומד ולאפשר לו להתייבש בקופסת ג'ל סיליקה ב-RT למשך 30 דקות.
2. הרכבת Immunoassay מבוסס נייר
- הסר בזהירות את סרט המגן בצד האחורי של כרטיס הגיבוי מפלסטיק הדבק כדי לחשוף את הדבק.
- יישרו את נייר התאית המטופל עם כרטיס הגיבוי מפלסטיק דביק ולחצו בחוזקה את שתי השכבות זו לזו.
הערה: הימנע מלגעת בשדה ההידרופילי כדי למזער את הסיכון לזיהום או נזק למכשיר. - מרחו סרט פלסטיק כדי לצפות את הנייר ולחצו אותם יחד.
- גזור את חתיכת המכשירים הרצויה באמצעות מספריים מגיליונות של מכשירים התאספו לחלוטין.
- ה-DEN-NS1-PADs (איור 1C) מוכנים כעת לשימוש. ליציבות ארוכת טווח, אחסנו אותם בטמפרטורה של 4°C.
3. הכנת הצמידות AuNPs-Ab
הערה: AuNPs-Ab הוכן כפי שתואר קודם לכן על ידי Prabowo et al.36.
- ערבבו 10 μL של נוגדן 1 מ"ג mL−1 נגד NS1 ב-PBS, 1 מ"ל של קולואיד AuNPs 40 ננומטר ו-0.1 מ"ל של חיץ בוראט 0.1 M (pH 8.5).
- סובבו את התערובת ב-50 סל"ד למשך 60 דקות ודגרו ב-RT.
- יש למרוח 0.1 מ"ל של 10 מ"ג מ"ל−1 BSA ב-BBS, לסובב ב-50 סל"ד ולדגור ב-RT למשך 15 דקות.
- צנטריפוגה את התמיסה ב 20,187 × גרם ו 4 ° C במשך 30 דקות.
- בזהירות פיפטה ולהפריד את supernatant מן auNPs-Ab המואץ.
- השהה מחדש את AuNPs-Ab ב- 500 μL של BBS ופזר אותו באמצעות סוניקציה.
- יש לחזור על פעולת הצנטריפוגה בטמפרטורה של 20,187 × גרם ו-4°C למשך 30 דקות.
הערה: חזור על תהליכי הפיזור והצנטריפוגה 3x. - הוסף 50 μL של המאגר המצומד למתלים, מה שהופך אותו מוכן ליישום על האזור המצומד.
4. פיתוח אפליקציות מובייל
- עיבוד תמונה ופיתוח למידת מכונה
- אסוף ערכת נתונים עבור מודל תמונה מפוקח על-ידי איסוף למעלה מ-900 תמונות עם מיקוד אוטומטי של DEN-NS1-PADs, לכידת תנאים שונים כגון ריכוזים שונים, מותגי מצלמה (12-13 מגה-פיקסל), סיבובים (90° ו-180°) והגדרות תאורה. כוונו ל-30 תמונות בכל תנאי ספציפי.
- תייגו את האמת הקרקעית על ידי זיהוי וביאור שני תחומי עניין כאזורי הבחינה והבקרה בתוך התמונות שנאספו ללמידה מפוקחת.
- עצב אלגוריתם לזיהוי רצועת הרקע. אתר את קו האמצע בין אזורי הבדיקה והביקורת, חשב את נקודת האמצע שלו וקבע אזור ריבועי פרופורציונלי לגודל הממוצע של שני האזורים העיקריים תוך שמירה על אותו כיוון סיבוב.
- צור מודל פילוח תמונות באמצעות מערך הנתונים ותוויות האמת הקרקעיות משלבים 4.1.1 ו- 4.1.2 כדי לאמן מודל פילוח תמונה לזיהוי אזורי העניין.
- אלגוריתם יישום
- החל את מודל פילוח התמונות המיומן על תמונות חדשות כדי לאתר את אזורי הבדיקה, הבקרה והרקע באופן אוטומטי.
- השתמש בטכניקות עיבוד תמונה בסיסיות כדי לקבל ערך עוצמה יחיד לכל אחד משלושת אזורי העניין (בדיקה, בקרה ורקע).
- המר את התמונה לייצוג מערך תלת-ממדי (y, x ערוצים) כדי לגשת לערכי פיקסלים.
- המירו את התמונה לגווני אפור באמצעות ממוצע ערכי RGB והחילו היפוך עם הנוסחה (255x).
- נרמל את ערכי אזור הבדיקה והבקרה על-ידי הפחתת ערך אזור הרקע.
- השתמש בעקומת הכיול שנקבעה מראש כדי לחשב את הריכוז של NS1.
- סווג את התוצאות כחיוביות או שליליות בהתבסס על ערך חיתוך של 0.1103 הנגזר מעוצמות גווני האפור המנורמלות37.
5. עקומת כיול ורגישויות
- הכינו דגימת NS1 בסרום אנושי לכיול בריכוזים של 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ו-1.0 מיקרוגרם מ"ל-1.
- זרוק 50 μL מכל ריכוז על אזור הדגימה ובצע מדידות במשולש.
- אפשר את הדגימות לפתל לחלוטין לתוך המכשיר, אשר עשוי לקחת 20-30 דקות כדי לקבל תוצאות.
- צלם תמונות של המכשיר באמצעות מצלמה דיגיטלית או טלפון חכם לאחר 5 דקות של דגירה.
- נתח את אזורי הבדיקה והבקרה באמצעות ImageJ ויישום נייד מותאם אישית.
- בנה את עקומת הכיול בהתבסס על נתונים מ- ImageJ ומהיישום הנייד.
- חשב את הגבול של ריק (LOB), את גבול הזיהוי (LOD) ואת גבול הכימות (LOQ) באמצעות משוואות (1-3) להלן:
LOB = ממוצע הנתונים הריקים + 1:645* ð (סטיית תקן של נתונים ריקים) (1)
LOD = LOB +1:645*ð (סטיית תקן של נתוני הריכוז הנמוכים ביותר) (2)
LOQ = ממוצע של נתונים ריקים + 10*ð (סטיית תקן של נתונים ריקים) (3)
6. ביצוע Immunoassay מבוסס נייר עם דגימות קליניות
- לאסוף ולעבד 300 μL של דם היקפי מ -30 חולים ביום הראשון של האשפוז לתוך צינורות EDTA העליון סגול, בעקבות שיטות קליניות טובות.
- צנטריפוגה את הדם ב 2,884 × גרם ו 4 ° C במשך 20 דקות.
- מעבירים את הרכיב הנוזלי (פלזמה) לצינור פוליפרופילן נקי באמצעות פיפטה.
- אחסנו את הפלזמה במקפיא מיד בטמפרטורה של -20°C לניתוח לאחר מכן.
- החל 20 μL של פלזמה על אזור הדגימה על גבי המכשיר. לאחר מכן, הוסף 30 μL של חיץ כביסה (0.05% v/v Tween 20 ב 1x פוספט חוצץ מלוחים).
- תנו לדגימה להתפתל לחלוטין לתוך המכשיר, מה שעשוי לקחת 20-30 דקות כדי לקבל את התוצאות.
- צלם תמונות של המכשיר באמצעות מצלמה דיגיטלית או טלפון חכם לאחר 5 דקות דגירה בטמפרטורת החדר.
- נתח את אזורי הבדיקה והבקרה באמצעות ImageJ ויישום נייד מותאם אישית.
7. כימות עם יישום נייד
הערה: העוצמה של בדיקה חיסונית מבוססת נייר מנותחת ביישום הנייד (איור 2).
- פתח את היישום הנייד שפותח בטלפון החכם.
- בחר השתמש במצלמה או העלה מהגלריה כדי לבחור או להעלות את מקור הנתונים. עשה זאת באמצעות לכידת מצלמה או על-ידי בחירת תמונה מגלריית המכשיר.
- נווט אל המקטע האנליטי וגע בלחצן נתח על המסך.
- המתן עד שהיישום ינתח את הנתונים ויציג את התוצאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בחירת שיטת ייצור היא חיונית כדי להבטיח ביצועי בדיקה הניתנים לשחזור במכשירי בדיקה מבוססי נייר. במחקר שלנו, בחנו תהליכי ייצור וחומרים שונים בהקשר של הדגמת אימונואסייה מבוססת נייר. השיטה שבחרנו משתמשת במערכת הדפסת שעווה ליצירת מחסומים הידרופוביים בתוך התקנים מיקרופלואידים מבוססי נייר. גישה זו בולטת בשל פשטותה, מהירותה ותוצאותיה העקביות. יש לציין כי הוא מציע את היתרון של הימנעות משימוש בכימיקלים פוטו-עמידים, שיש להם פוטנציאל להפריע לספיחת חלבונים ולהגביר את ההידרופוביות של נייר תאית. יתר על כן, הדפסת שעווה מבטיחה ממדים עקביים של ערוצים זורמים, ותורמת לביצועי בדיקה חוזרים.
בעקבות היווצרות מחסומים הידרופוביים, הריאגנטים הדרושים עבור immunoassay יושמו על פני נייר תאית. עם ספיחה אלקטרוסטטית, PLL סייע באימוביליזציה של ביומולקולות על ידי אינטראקציה הן עם המטען החיובי של קבוצות תפקודיות אמין והן עם נוגדן טעון שלילי. צעד זה מאפשר שינוי והשתקה של נוגדנים ויישום של הצמדות נוגדנים תווית במהלך תהליכי הייצור. חשוב לציין, שלב זה יכול להתבצע במקביל. ההרכבה של התקני אימונואסאי מנייר (DEN-NS1-PAD, כפי שמוצג באיור 1A) הושלמה על-ידי הערמת הנייר שהשתנה על כרטיס גיבוי פלסטיק דביק והלבנה שלו עם סרט פלסטיק.
המטרה העיקרית של מחקר זה היא לפתח שיטה ידידותית למשתמש המשתמשת בטלפון חכם למדידת ריכוזי NS1. גישה זו יכולה לשמש כמכשיר לבדיקת נקודת טיפול (POCT) הן בסביבה ביתית והן בסביבה קלינית. בהתחשב בטווח הרחב של ריכוזי NS1 בסרום המטופלים, נעשה שימוש במודלים ליניאריים פשוטים המבוססים על תוצאות ניסויים אלה. עבור כל ריכוז NS1 הוכן מערך נתונים הכולל שלושה מכשירי בדיקה. תמונות המכשירים צולמו באמצעות סמארטפון תחת הגדרות סטנדרטיות ותנאי תאורה אופטימליים, מה שמבטל את הצורך בקופסה חשוכה. אזור הבדיקה של PADs מכיל נוגדן חד שבטי NS1 דנגי עכבר, בעוד אזור הבקרה כולל נוגדן IgG נגד עכבר עז. בפורמט בדיקת סנדוויץ', ריכוזי NS1 גבוהים יותר בדגימות תואמים לעוצמה מוגברת של צבע אדום באזור הבדיקה. לעומת זאת, עוצמת הצבע באזור הבקרה נשארת קבועה יחסית. איור 1B מציג תמונות לא מעובדות של טלפונים חכמים, אשר מספקות תצפית חזותית מועילה ללא צורך בציוד מיוחד.
באמצעות אפליקציה ייעודית לנייד, נרמלנו את העוצמות וחישבנו מודלים ליניאריים פשוטים עבור ריכוזי NS1 קוצניים בדגימות בסרום - מתאם המקדם (r2) המתקבל מהיישום הנייד. מתאם המקדם (r2) שהתקבל מהאפליקציה הסלולרית היה 0.92 (איור 3), בהתאם לציפיות. גישה זו המבוססת על טלפונים חכמים השיגה ביצועים טובים יותר מתצפית בעין בלתי, ושיפרה משמעותית את הרגישות ב -178%. בנוסף, חושבו גבול הריק (LoB), גבול הזיהוי (LoD) וגבול הכימות (LoQ) עבור העוצמות המנורמלות, כפי שמוצג בטבלה 1.
דגימות קליניות בעולם האמיתי שימשו כדי להדגים את הפונקציונליות המעשית של DEN-NS1-PADs בסביבות קליניות. הבדיקה החיסונית מבוססת הנייר הפיקה קריאות צבע איכותיות תוך 20-30 דקות, ואפשרה קביעה חזותית של תוצאות שליליות או חיוביות. דגימות סרום מחולים החשודים בדנגה היו חשופות למכשיר. איור 4 ממחיש ומשווה את התוצאות שהתקבלו הן מהמכשיר והן מבדיקת אבחון מהירה מסחרית (RDT). טבלה 2 מסכמת את התוצאות של קריאות חזותיות ושל מערכת מבוססת טלפונים חכמים. ה-RDT המסחרי והמכשיר הניבו תוצאות דומות, עם שבע תוצאות חיוביות ו-23 שליליות מקריאה חזותית. לעומת זאת, מערכת הקוראים מבוססת הסמארטפונים המיושמת באופן בלעדי על המכשיר דיווחה על תשע תוצאות חיוביות ו-21 שליליות מדגימות קליניות.
איור 1: תמונות של DEN-NS1-PAD מתוכנן ומפוברק. (A,B) תעלה יחידה מהמחסום ההידרופובי בדוגמת שעווה מתוכננת ומתוארת בשלושה מצבים: (C) לפני ו-(D,E) לאחר הצגת תמיסת הדגימה לאזור המיועד והצגת התוצאות (D) השליליות ו-(E) החיוביות, בהתאמה. פתרון הדגימה מתפתל דרך הערוץ (ראה חץ מסומן), אינטראקציה עם הרכיבים במיקומים מרכזיים - AuNPs-Ab באזור המצומד, נוגדן אנטי NS1 באזור הבדיקה (אינדיקציה לתוצאת דנגי NS1 חיובית), ונגד עכבר IgG באזור הבקרה. התוצאות ניתנות לצפייה בקלות בעין בלתי וניתן לכמת אותן באמצעות עיבוד תמונה באמצעות סורק שטוח או מצלמת סמארטפון. קיצור: AuNPs-Ab = ננו-חלקיקי זהב-צימוד נוגדנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: צילומי מסך של מסך הטלפון מהאפליקציה לנייד. (A) מסך המשתמש של אפליקציית Android הפועלת במכשיר הטלפון הנייד, (B) תצוגה של מסך היישום, (C) התפריט הראשי של היישום שהמשתמשים יכולים לבחור להשתמש במצלמה או להעלות תמונה מהגלריה, (D) תצוגה של תמונה קשורה לבדיקה, (E) תצוגה של זמן הספירה לאחור לניתוח, (ו) הצגת תוצאות הבדיקה, לרבות עוצמת אזור הבדיקה והבקרה, החלטת ההדבקה (חיובית/שלילית) וריכוז NS1 בדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עקומת כיול ליניארית לזיהוי NS1 בסרום. המכשיר שימש ותמונות פורשו על ידי עיבוד באמצעות יישום המבוסס על נתוני הטלפון החכם. קווי השגיאה מציגים ±1 סטיית תקן, n = 3. קיצורים: T = אזור הבדיקה; C = אזור בקרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונה של DEN-NS1-PAD מבדיקת המדגם הקליני. סרום (50 μL) שימש במערכת חיסונית מבוססת נייר. (A) דוגמה לתוצאה שלילית, (B) תוצאות חיוביות, (C) תוצאות כלליות והשוואה של RDT לעומת אימונואסייה מבוססת נייר. קיצורים: RDT = בדיקת אבחון מהירה; Pos = חיובי; נג = שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| פרמטר | עיניים בלתי | אפליקציה לנייד |
| מגבלת ריק (LoB) | - | 43.15 ננוגרם מ"ל-1 |
| מגבלת זיהוי (LoD) | 200 ננוגרם מ"ל-1 | 112.19 ננוגרם מ"ל-1 |
| מגבלת כימות (LoQ) | - | 373.58 ננוגרם מ"ל-1 |
טבלה 1: LoB, LoD ו- LoQ מ- ImageJ ויישום נייד בתקן כיול נתונים NS1 בסרום. קיצורים: LoB = גבול הריק; LoD = גבול הזיהוי; LoQ = גבול הכימות.
| מטופל מס' | עיניים בלתי | אפליקציה לסמארטפון | ImageJ | |
| RDT | Immunoassay מבוסס נייר | |||
| 1 | - | - | - | - |
| 2 | - | - | - | - |
| 3 | - | - | - | - |
| 4 | - | - | - | - |
| 5 | - | - | - | - |
| 6 | - | - | - | - |
| 7 | - | - | - | - |
| 8 | - | - | - | - |
| 9 | + | + | + | + |
| 10 | - | - | + | + |
| 11 | - | - | - | - |
| 12 | + | + | + | + |
| 13 | - | - | - | - |
| 14 | - | - | - | - |
| 15 | - | - | - | - |
| 16 | + | + | + | + |
| 17 | + | + | + | + |
| 18 | - | - | - | - |
| 19 | - | - | - | - |
| 20 | - | - | - | - |
| 21 | + | + | + | + |
| 22 | + | + | + | + |
| 23 | - | - | - | - |
| 24 | + | + | + | + |
| 25 | - | - | - | - |
| 26 | - | - | - | - |
| 27 | - | - | - | - |
| 28 | - | - | - | - |
| 29 | - | - | - | - |
| 30 | - | - | + | + |
טבלה 2: השוואה בין תוצאות מערכת קריאה חזותית ומערכת קורא מבוססת סמארטפון עבור דגימות בסרום. (+) ו-(-) מצביעים על פרשנויות חיוביות ושליליות של התוצאות, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחד הפרמטרים החשובים לתכנון עבור מערכת קוראים מבוססת סמארטפון הוא היכולת לספק עיבוד הדמיה ניתן לשחזור של דגימות. במחקר זה, לשם פשטות ונוחות, התמונות צולמו משלושה מותגי סמארטפונים שונים עם מצלמות 12-13 מגה פיקסל ללא שימוש בקופסת הדמיה או אביזרים. תנאים משתנים של לכידת תמונה, כגון רזולוציית המצלמה, זמן לכידת תמונה, תנאי תאורה וסביבה, יכולים להשפיע על עוצמת הצבע של נקודות הבדיקה והבקרה במכשיר. ההשפעה של זמני לכידת תמונות שונים על התאורה והייבוש של PAD על עוצמות האות של המכשירים צומצמה על ידי שימוש בעוצמות האות המנורמלות, שנותרו עקביות בין תמונות שצולמו בזמנים שונים36. חיסור אות רקע התגלה כאסטרטגיה לשיפור הדיוק של מדידות עוצמת הצבע, ולמעשה למתן את השפעת תנאי התאורה. הממצא שלנו עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים המדגישים את היעילות של טכניקות חיסור בסיסיות או רקע במזעור ההשפעות הסביבתיות39,40.
לוויכוח המתמשך סביב עליונות השימוש בקופסת הדמיה או בשיטה נטולת אביזרים יש השלכות על עיבוד תמונה39,41. תיבת הדמיה יכולה לשפר את החוסן של תוצאות עיבוד הדמיה על ידי מזעור שינויים בתנאי הדמיה 41,42,43. במחקר זה, השתמשנו ביישום נייד המבוסס על למידת מכונה בענן לעיבוד תמונה. גישה זו ממנפת למידת מכונה בתוך פלטפורמה מבוססת ענן כדי לסווג, לחלץ ולהעשיר נתוני תמונה באופן אוטומטי. היישום זיהה ועיבד ביעילות את אזור העניין בתוך תמונות, והקיף את אזורי הרקע, הבדיקה והבקרה. צעד זה היה מכריע בהבחנה בין אזוריםאלה 38. מחקרים קודמים מצביעים על כך שעיבוד תמונה הכולל למידת מכונה מניב סיווג מעולה בין תוצאות עבור דגימות בקרה ובדיקה 43,44,45. במחקר זה, שימוש במיקום הקבוע ובחיסור הרקע יצר אות רקע עקבי מתאי התאית μPADs, מה ששיפר את העקביות ואת דיוק הסיווג של הקריאות שסופקו על ידי היישום הנייד40,43.
באשר לביצועים העקביים בהדגמת אימונואסייה מבוססת נייר, שיטת הייצור ממלאת תפקיד חשוב. במחקר קודם36 נחקרו מספר תנאי אופטימיזציה לשיטת התכנון והייצור של DEN-NS1-PAD, כגון ריכוזים של PLL, חומר חוסם ונוגדן NS1. המכשיר בדק בהצלחה את NS1 בחיץ, בתרבית תאים ובסרום אנושי הן מבחינה איכותית והן מבחינה כמותית.
אפקטים של מטריצה הנובעים מרכיבי סרום יכולים להפריע למגבלת הזיהוי של המכשיר בעת בדיקת דגימות בסרום. עם זאת, התוצאות מצביעות על כך שהחיסון שפותח יכול לזהות בהצלחה ריכוזי NS1 בדגימות בסרום, ולייצר תוצאות דומות לאלה של RDT מסחרי (טבלה 2). התוצאות הנראות לעין באמצעות בדיקה חזותית והאפליקציה הסלולרית (איור 4) נצפו, והדגישו את יעילות הבדיקה לבדיקת נסיוב. בעוד שהצמיגות הגבוהה יותר של הסרום עשויה להשפיע על זמני הניתוח, היא אינה מעכבת את פירוש התוצאה36. שימוש ביישום נייד יכול לספק תוצאות חיוביות יותר עבור בדיקות לדוגמה מכיוון ששימוש ביישום נייד משפר באופן משמעותי את הרגישות של בדיקות מדגם46. ראוי לציין כי יש צורך בהשוואות נוספות עם בדיקות מולקולריות כגון RT-PCR 15,47,48 עבור דנגי NS1 כדי לקבוע תוצאות חיוביות כוזבות או שליליות שגויות פוטנציאליות.
מגבלה בולטת של מחקר זה מתעוררת כאשר בוחנים מטריצה דגמית מורכבת יותר כגון דם. הרכיבים הנמצאים בדם אכן עלולים להפריע למגבלת הזיהוי של המכשיר. במקרים כאלה, שימוש ברפידות סופגות נוספות כדי לשפר את ספיגת חיץ הריצה מהווה פתרון אפשרי. שינוי זה יכול לסייע בקרישת הדם, למנף את התכונות המוסטיפטיות של תאית על ידי השפעה על טסיות הדם49. גישה אחרת כוללת מריחת 4% (w/v) טיפות מלח על כרית הדגימה כדי לשפר את קרישת הדם. מחקרים קודמים הוכיחו כי מלחים כגון סידן כלורי ונתרן כלורי גורמים לקרישת תאי דם אדומים (RBC)50,51. Na+ יכול לערער את ההשעיה של RBCs בדם על ידי דיכוי השכבה החשמלית הכפולה על פני השטח של RBC והפחתת דחיית המטען בין RBCs. בנוסף, ריכוז גבוה של מלח גם גורם לצבירת דם52. יתר על כן, מטען ערכיות היונים הנגדיים של Na+ מדכא את עובי השכבה הכפולה הטעונה של RBCs, מה שמוביל לצבירה של RBCs מנופחים. תוספת של 4% (w/v) תמיסת מלח (NaCl) מקלה על הפרדת פלזמה על נייר תאית51. עם זאת, אופטימיזציה זהירה של ריכוז המלח נחוצה כדי למנוע גרימת השפעות בלתי רצויות על צבירת דם וצבירת ננו-חלקיקי זהב53,54.
מדפסות שעווה מסחריות סיפקו שילוב אידיאלי של עלות ופשטות של אב טיפוס. מכיוון שמדפסות אלה הופסקו בשנת 2016, נדרשו שיטות ייצור חלופיות כגון הדפסת הזרקת דיו55, הדפסת רשת56 ופוטוליתוגרפיה57. מדפסת טונר משרדית היא מועמדת טובה לייצור μPAD. שרף הפוליאסטר בטונר יוצר תבניות הידרופוביות ב-200°C למשך 60 דקות עם עיצובים שונים58.
נוגדן NS1 סרוטיפ שתיים, כפי שצוין על ידי החברה, שימש במחקר זה. עם זאת, מצאנו כי נוגדן זה גם אינטראקציה עם כל הסרוטיפים36,37. הרגישויות לגילוי DENV-4 נמוכות יותר (87.5%) בהשוואה לסרוטיפים אחרים. הרגישות של DENV-1 ו- DENV-2 היא כ- 88.89%, ועבור DENV-3 היא 100%37. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים, אשר דיווחו גם על רגישות נמוכה יותר של RDT ל- DENV-4 בהשוואה לסרוטיפים אחרים59. הרגישות הכוללת של המכשיר היא ~ 88.89%, עם ספציפיות של כ 86.67%. ראוי לציין כי הרגישות בפועל של DEN-NS1-PAD עשויה לעלות על זו של RDT מסחרי. עם זאת, RDT מדגים ערך ניבוי חיובי (PPV) של 84.62% ודיוק של 87.67%. יש לציין כי ה- DEN-NS1-PAD הפגין ביצועים טובים יותר באיתור זיהום דנגי ב 5-6 הימים הראשונים, ואילו RDT יעיל רק ב -5 הימים הראשונים37.
לסיכום, שילוב של בדיקה חיסונית ניידת מבוססת נייר (DEN-NS1-PAD) עם יישום סמארטפון טומן בחובו הבטחה גדולה למדידת דנגי NS1. היישום הנייד משפר באופן משמעותי את הרגישות והיעילות בכימות NS1 בדגימות בסרום בהשוואה לתצפית בעין בלתי. היתרונות של היישום הנייד כוללים זמן ניתוח מופחת, ידידותיות למשתמש ותאימות עם מכשירי סמארטפון מגוונים, מיקומים ותנאי תאורה. עם זאת, יש צורך בשיפור נוסף כדי לשפר את הרגישות והביצועים. בינתיים, שינוי של immunoassay מבוסס נייר יש צורך לשפר את הביצועים שלה כאשר מתמודדים עם דגימות דם. יתר על כן, נדרשות הערכות מקיפות של DEN-NS1-PAD לאיתור דנגי באמצעות מספר משמעותי יותר של סרוטיפים זיהומיים ראשוניים ודגימות נבחרות שנאספו מחולים שונים (ילדים ומבוגרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
M.H.P. מודה בהכרת תודה לקרן המחקר של Universitas Islam Indonesia (UII). המחברים מודים למר Nutchanon Ninyawee על מומחיותו רבת הערך וסיועו בפיתוח האפליקציה הניידת ותרומתו לכתב היד. יתר על כן, המחברים מעריכים את התמיכה הכספית הניתנת על ידי תאילנד מדע מחקר וחדשנות (TSRI), קרן מחקר בסיסית: שנת הכספים 2023 (פרויקט מס '. FRB660073/0164) במסגרת תוכנית בריאות חכמה של האוניברסיטה הטכנולוגית של המלך מונגקוט תונבורי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10x30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
References
- Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
- World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , WHO, Geneva. 1-34 (2012).
- WHO Dengue and severe dengue. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
- Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
- Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
- Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570 (2014).
- Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
- Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102 (2015).
- Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673 (2017).
- Lin, C. -F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
- Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
- Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409 (2013).
- Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341 (2013).
- Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
- World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control -- New edition. , https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789241547871 (2009).
- Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
- Kim, S. -W., Cho, I. -H., Lim, G. -S., Park, G. -N., Paek, S. -H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
- Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
- Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V.
- Hu, J., et al.
- Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
- Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
- Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
- He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
- Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
- Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104 (2018).
- Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
- Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D.
- Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1 (2015).
- Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
- Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678 (2012).
- Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
- Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291 (2017).
- You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
- Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
- Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
- Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. Prabowo, M. H., et al. , 1901000816 (2019).
- Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
- Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800 (2020).
- Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
- Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203 (2017).
- Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84 (2017).
- Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
- Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7 (2019).
- Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391 (2018).
- Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
- Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
- Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
- Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
- Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376 (2014).
- Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
- Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
- Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
- Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
- Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
- Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).
