Summary
Para abordar las necesidades urgentes de diagnóstico del dengue, aquí presentamos un dispositivo analítico en papel basado en el dengue NS1 integrado en la aplicación para teléfonos inteligentes (DEN-NS1-PAD) para cuantificar la concentración del antígeno NS1 del dengue en muestras clínicas de suero/sangre. Esta innovación mejora el manejo del dengue al ayudar a la toma de decisiones clínicas en diversos entornos de atención médica, incluso en los de recursos limitados.
Abstract
La infección por el virus del dengue (DENV), que es transmitida por los mosquitos Aedes , es un importante problema de salud pública en los países tropicales y subtropicales. Con una incidencia anual de aproximadamente 10 millones de casos y entre 20.000 y 25.000 muertes, especialmente entre los niños, existe una necesidad urgente de herramientas prácticas de diagnóstico. La presencia de la proteína no estructural 1 (NS1) del dengue durante la infección temprana se ha relacionado con la liberación de citocinas, la fuga vascular y la disfunción endotelial, lo que la convierte en un marcador potencial de dengue grave.
Los inmunoensayos basados en papel, como los ensayos de flujo lateral (LFA) y los dispositivos analíticos microfluídicos basados en papel (PAD), han ganado popularidad como pruebas diagnósticas debido a su simplicidad, rapidez, bajo costo, especificidad y facilidad de interpretación. Sin embargo, los inmunoensayos convencionales en papel para la detección del dengue NS1 suelen basarse en la inspección visual, lo que solo arroja resultados cualitativos. Para abordar esta limitación y mejorar la sensibilidad, propusimos un ensayo de detección de dengue NS1 altamente portátil en un dispositivo analítico basado en papel (PAD), a saber, DEN-NS1-PAD, que integra una aplicación de teléfono inteligente como lector colorimétrico y cuantitativo. El sistema de desarrollo permite la cuantificación directa de las concentraciones de NS1 en muestras clínicas.
Se utilizaron muestras de suero y sangre obtenidas de los pacientes para demostrar el rendimiento del prototipo del sistema. Los resultados se obtuvieron de inmediato y pueden emplearse para la evaluación clínica, tanto en centros de salud bien equipados como en entornos de recursos limitados. Esta innovadora combinación de un inmunoensayo en papel con una aplicación para teléfonos inteligentes ofrece un enfoque prometedor para mejorar la detección y cuantificación del antígeno NS1 del dengue. Al aumentar la sensibilidad más allá de las capacidades del ojo humano, este sistema tiene un gran potencial para mejorar la toma de decisiones clínicas en el manejo del dengue, particularmente en áreas remotas o desatendidas.
Introduction
La infección por el virus del dengue (DENV) es la enfermedad transmitida por mosquitos que se propagamás rápidamente 1, y más de 390 millones de personas están infectadas con 96 millones de infecciones sintomáticas, 2 millones de casos de enfermedad grave y más de 25.000 muertes al año ocurren en el mundo 1,2. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que 3.900 millones de personas están en riesgo de contraer dengue; ~70% vive en países de Asia Pacífico y principalmente en el sudeste asiático3. En 2019, el número de casos de dengue notificados a la OMS fue de 4,2 millones, y Tailandia aportó al menos 136.000 casos de dengue y 144 casos de muerte por infección por dengue4. El brote de dengue en Tailandia se produce durante la temporada de lluvias, de abril a diciembre, tanto en zonas urbanas como rurales, especialmente en la zona nororiental.
Las infecciones por DENV tienen diferentes manifestaciones clínicas que van desde síntomas subclínicos, dengue leve (DF) hasta dengue hemorrágico grave (DH). La característica principal de la afección grave de DH es el aumento de la permeabilidad vascular seguido de shock y disfunción orgánica1. Comprender la vía molecular que puede causar la fuga vascular es muy importante para desarrollar tratamientos eficaces contra el dengue. La proteína no estructural 1 (NS1) del dengue es una glicoproteína secretada durante la infección temprana por virus 5,6 y funciona como un cofactor para la replicación del ARN viral7. NS1 puede desencadenar la liberación de citocinas y contribuir a la fuga vascular al unirse al receptor tipo toll 4 (TLR4) y al glicocálix endotelial 8,9. La investigación in vitro ha demostrado que NS1 interactúa con las células endoteliales e induce la apoptosis. Esta condición puede contribuir a la disfunción endotelial y a la fuga vascular10. Los niveles de antígeno NS1, correlacionados con los niveles séricos de interleucina (IL)-10, aumentaron significativamente en pacientes con enfermedad clínica grave11. El dengue NS1 también contribuye a la patogénesis de la enfermedad mediante la inducción de IL-10 y la supresión de las respuestas de las células T específicas del DENV12,13. Además, la proteína NS1 del dengue se relacionó con la enfermedad clínica grave, y la concentración de NS1 > 600 ng mL-1 en los primeros 3 días de la enfermedad se asoció con el desarrollo de DH14.
La persistencia del antígeno NS1 del dengue en pacientes con DH podría ser utilizada como marcador de dengue grave6. Existen varios métodos para detectar NS1 en muestras clínicas, como el ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y la prueba rápida15. El estándar de oro para medir la concentración de proteínas NS1 en un entorno clínico es el método ELISA. Sin embargo, el método ELISA es costoso y requiere personal calificado e instalaciones de laboratorio16. Por lo tanto, el desarrollo de tecnología para detectar y cuantificar las proteínas NS1 en la prueba en el punto de atención (POCT) aún está en curso. En la última década, los inmunoensayos basados en papel, como los ensayos de flujo lateral (LFA) y los dispositivos analíticos microfluídicos basados en papel (μPAD), se han vuelto populares como pruebas diagnósticas debido a su simplicidad, rapidez, bajo costo y especificidad 17,18,19. En un inmunoensayo basado en papel, se han utilizado varias etiquetas para generar señales, como nanopartículas de oro (AuNPs)20, nanopartículas magnéticas21,22, puntos cuánticos23 y materiales de fluorescencia24,25. Las AuNP son las etiquetas más comunes utilizadas en los inmunoensayos en papel debido a su bajo costo de producción, facilidad de fabricación, estabilidad y lectura simple. En la actualidad, los ensayos de flujo lateral (LFA) para el dengue NS1 se utilizan de forma conocida en el ámbito clínico26,27. Sin embargo, la detección convencional de etiquetas LFA suele utilizarse a simple vista y solo proporciona resultados cualitativos.
En la última década, más de 5 mil millones de teléfonos inteligentes se han utilizado ampliamente en todo el mundo, y existe potencial para desarrollar la detección portátil28,29. Los teléfonos inteligentes tienen capacidades multifuncionales, como sensores físicos incorporados, procesadores multinúcleo, cámaras digitales, puertos USB, puertos de audio, software inalámbrico y de aplicaciones, lo que los hace adecuados para su uso en diversas plataformas de biosensores30. Además, las tecnologías inalámbricas permiten el envío rápido de datos y pueden utilizarse para la vigilancia in situ y en tiempo real31. Mudanyali et al. combinaron el inmunoensayo en papel y los teléfonos inteligentes para desarrollar una plataforma POCT portátil, sin equipos, rápida, de bajo costo y fácil de usar para la malaria, la tuberculosis y el VIH32. Ling et al. informaron de un ensayo de flujo lateral combinado con la cámara de un teléfono inteligente para detectar cuantitativamente la actividad de la fosfatasa alcalina en la leche33. Hou et al. también desarrollaron un sistema de imágenes de doble modalidad basado en teléfonos inteligentes para señales cuantitativas de color o fluorescencia en el ensayo de flujo lateral34. Además, el uso del teléfono inteligente como lector colorimétrico y cuantitativo puede mejorar la sensibilidad, mientras que a simple vista no se puede informar con seguridad de la presencia del objetivo35.
El DEN-NS1-PAD 36,37,38 (en adelante, el dispositivo) representa un gran avance en el diagnóstico del dengue y ofrece una solución portátil y eficiente. Utilizando tecnología basada en papel microfluídico impreso en cera, este dispositivo cuantifica NS1 con alta sensibilidad y especificidad a través del procesamiento de imágenes. Para mejorar aún más su utilidad, hemos desarrollado una aplicación para teléfonos inteligentes fácil de usar para la lectura colorimétrica y cuantitativa. La validación clínica utilizando muestras de pacientes de hospitales tailandeses subraya su impacto inmediato en la evaluación de pacientes en tiempo real. Nuestra innovación marca un avance fundamental en el manejo optimizado del dengue en el punto de atención, y promete revolucionar el diagnóstico en entornos de atención médica con recursos limitados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El Comité de Ética de la Junta de Revisión Institucional, Departamento Médico del Real Ejército Tailandés, Hospital Phramongkutklao, Bangkok, Tailandia (IRBRTA 1218/2562) otorgó la aprobación. Al llevar a cabo este estudio, cumplimos con todas las normas éticas necesarias.
1. Fabricación del dispositivo del inmunoensayo en papel
NOTA: El dispositivo de inmunoensayo basado en papel se fabricó siguiendo los métodos previamente establecidos36,37 y la solicitud de patente tailandesa n.º 19010081638.
- Diseño y dibujo de patrones: Diseñe el dispositivo analítico de papel (Figura 1A, B) con 18 patrones de cera PAD en una computadora.
NOTA: El diseño es específico y está pensado para papel de tamaño A5. El número de PADs está relacionado con el tamaño del papel, según lo requiera el usuario. - Imprima el patrón diseñado en el papel de celulosa utilizando una impresora de cera (Tabla de materiales).
- Derretir el papel impreso en cera en un horno de laboratorio durante 75 s a 150 °C. Posteriormente, guárdelo en una caja de sílice hasta que lo necesite para los pasos posteriores.
- Aplique 0,5 μL de poli-L-lisina (PLL) al 0,025% tanto en la zona de prueba como en la de control. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 2 min en una caja de sílice y luego calentar en el horno a 65 °C durante 5 min.
- Aplicar 0,5 μL de 1 μg μL-1 de anticuerpo IgG anti-ratón de cabra en el área de control y 0,5 μL de 1 μg μL-1 del anticuerpo de captura en el área de prueba. Deje que las gotas se sequen en una caja de gel de sílice a temperatura media durante 30 minutos.
- Aplique 2 μL del tampón de bloqueo en el área de la muestra, 3 μL en el área conjugada y 2 μL en el área de detección. Deje que las gotas se sequen en RT en una caja de gel de sílice durante 30 min.
- Aplique 2 μL de solución de complejo de nanopartículas-anticuerpos de oro (AuNPs-Ab) en el área conjugada y déjela secar en una caja de gel de sílice a RT durante 30 min.
2. Montaje del inmunoensayo en papel
- Retire con cuidado la película protectora en el reverso de la tarjeta adhesiva de plástico para exponer el adhesivo.
- Alinee el papel de celulosa tratado con la tarjeta adhesiva de plástico y presione firmemente las dos capas.
NOTA: Evite tocar el campo hidrófilo para minimizar el riesgo de contaminación o daño al dispositivo. - Aplica una película de plástico para cubrir el papel y presiónalos.
- Corte la pieza deseada de dispositivos con unas tijeras de hojas de dispositivos completamente ensamblados.
- Los DEN-NS1-PAD (Figura 1C) ya están listos para su uso. Para una estabilidad a largo plazo, guárdelos a 4 °C.
3. Preparación del conjugado AuNPs-Ab
NOTA: El AuNPs-Ab se preparó como se describió anteriormente por Prabowo et al.36.
- Combine 10 μL de 1 mg mL−1 de anticuerpo anti-NS1 en PBS, 1 mL de coloide de AuNPs de 40 nm y 0,1 mL de tampón borato 0,1 M (pH 8,5).
- Gire la mezcla a 50 rpm durante 60 min e incube a RT.
- Aplique 0,1 mL de 10 mg mL−1 BSA en BBS, gire a 50 rpm e incube a RT durante 15 min.
- Centrifugar la solución a 20,187 × g y 4 °C durante 30 min.
- Pipetear y separar cuidadosamente el sobrenadante del AuNPs-Ab precipitado.
- Resuspender el AuNPs-Ab en 500 μL de BBS y dispersarlo mediante sonicación.
- Repetir la centrifugación a 20.187 × g y 4 °C durante 30 min.
NOTA: Repita los procesos de dispersión y centrifugación 3 veces. - Agregue 50 μL del tampón conjugado a la suspensión, preparándola para su aplicación en el área conjugada.
4. Desarrollo de aplicaciones móviles
- Desarrollo de procesamiento de imágenes y aprendizaje automático
- Reúna un conjunto de datos para un modelo de imagen supervisado mediante la recopilación de más de 900 imágenes de enfoque automático de DEN-NS1-PAD, capturando diversas condiciones, como diferentes concentraciones, marcas de cámara (12-13 megapíxeles), rotaciones (90° y 180°) y ajustes de iluminación. Apunta a 30 imágenes bajo cada condición específica.
- Etiquete la verdad fundamental identificando y anotando dos regiones de interés como áreas de prueba y control dentro de las imágenes recopiladas para el aprendizaje supervisado.
- Diseñe un algoritmo para identificar la franja de fondo. Localice la línea central entre las regiones de prueba y de control, calcule su punto medio y establezca una región cuadrada proporcional al tamaño medio de las dos regiones principales manteniendo la misma orientación de rotación.
- Cree un modelo de segmentación de imágenes utilizando el conjunto de datos y las etiquetas de realidad del terreno de los pasos 4.1.1 y 4.1.2 para entrenar un modelo de segmentación de imágenes para identificar las regiones de interés.
- Algoritmo de aplicación
- Aplique el modelo de segmentación de imágenes entrenado a nuevas imágenes para localizar automáticamente las regiones de prueba, control y fondo.
- Utilice técnicas básicas de procesamiento de imágenes para obtener un único valor de intensidad para cada una de las tres regiones de interés (prueba, control y fondo).
- Transforme la imagen en una representación de matriz 3D (canal y, x) para acceder a los valores de píxel.
- Convierta la imagen a escala de grises promediando los valores RGB y aplique la inversión con la fórmula (255-x).
- Normalice los valores del área de prueba y control restando el valor del área de fondo.
- Utilice la curva de calibración preestablecida para calcular la concentración de NS1.
- Clasifique los resultados como positivos o negativos en función de un valor de corte de 0,1103 derivado de las intensidades normalizadas de la escala de grises37.
5. Curva de calibración y sensibilidades
- Preparar la muestra de NS1 en suero humano para su calibración con concentraciones de 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 μg mL-1.
- Deje caer 50 μL de cada concentración en el área de la muestra y realice las mediciones por triplicado.
- Deje que las muestras penetren completamente en el dispositivo, lo que puede tardar entre 20 y 30 minutos en obtener resultados.
- Capture imágenes del dispositivo con una cámara digital o un teléfono inteligente después de 5 minutos de incubación.
- Analice las áreas de prueba y control utilizando ImageJ y una aplicación móvil personalizada.
- Construya la curva de calibración a partir de los datos de ImageJ y la aplicación móvil.
- Calcule el límite de blanco (LOB), el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) utilizando las ecuaciones (1-3) siguientes:
LOB = Media de los datos en blanco + 1:645* ð (desviación estándar de los datos en blanco) (1)
LOD = LOB +1:645*ð (desviación estándar de los datos de concentración más bajos) (2)
LOQ = Media de los datos en blanco + 10*ð (desviación estándar de los datos en blanco) (3)
6. Realización de un inmunoensayo en papel con muestras clínicas
- Recolectar y procesar 300 μL de sangre periférica de 30 pacientes el primer día de hospitalización en tubos de EDTA de tapa morada, siguiendo las buenas prácticas clínicas.
- Centrifugar la sangre a 2.884 × g y 4 °C durante 20 min.
- Transfiera el componente líquido (plasma) a un tubo de polipropileno limpio con una pipeta.
- Almacene el plasma en el congelador inmediatamente a -20 °C para su posterior análisis.
- Aplique 20 μL de plasma en el área de la muestra en la parte superior del dispositivo. A continuación, añadir 30 μL de tampón de lavado (0,05% v/v Tween 20 en solución salina tamponada con fosfato 1x).
- Deje que la muestra penetre completamente en el dispositivo, lo que puede tardar entre 20 y 30 minutos en obtener los resultados.
- Capture imágenes del dispositivo con una cámara digital o un teléfono inteligente después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente.
- Analice las áreas de prueba y control utilizando ImageJ y una aplicación móvil personalizada.
7. Cuantificación con aplicación móvil
NOTA: La intensidad del inmunoensayo en papel se analiza en la aplicación móvil (Figura 2).
- Abra la aplicación móvil desarrollada en el teléfono inteligente.
- Seleccione Usar cámara o Cargar desde la galería para elegir o cargar la fuente de datos. Hazlo a través de la captura de la cámara o seleccionando una imagen de la galería del dispositivo.
- Vaya a la sección analítica y toque el botón Analizar en la pantalla.
- Espere a que la aplicación analice los datos y muestre los resultados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La selección de un método de fabricación es fundamental para garantizar un rendimiento de ensayo reproducible en dispositivos de inmunoensayo basados en papel. En nuestro estudio, exploramos varios procesos de fabricación y materiales en el contexto de la demostración de un inmunoensayo basado en papel. El método elegido utiliza un sistema de impresión de cera para crear barreras hidrofóbicas dentro de los dispositivos microfluídicos basados en papel. Este enfoque se destaca por su simplicidad, velocidad y resultados consistentes. Cabe destacar que ofrece la ventaja de evitar el uso de productos químicos fotorresistentes, que tienen el potencial de interferir con la adsorción de proteínas y aumentar la hidrofobicidad del papel de celulosa. Además, la impresión de cera garantiza dimensiones consistentes de los canales fluídicos, lo que contribuye a un rendimiento de ensayo repetible.
Tras la formación de barreras hidrofóbicas, se aplicaron los reactivos necesarios para el inmunoensayo a la superficie del papel de celulosa. Con la adsorción electrostática, el PLL ayudó en la inmovilización de la biomolécula al interactuar tanto con la carga positiva de los grupos funcionales de aminas como con el anticuerpo cargado negativamente. Este paso facilita la modificación e inmovilización de anticuerpos y la aplicación de conjugados marca-anticuerpo durante los procesos de fabricación. Es importante destacar que este paso se puede llevar a cabo en paralelo. El ensamblaje de los dispositivos de inmunoensayo de papel (DEN-NS1-PAD, como se muestra en la Figura 1A) se completa apilando el papel modificado sobre una tarjeta adhesiva de plástico y laminándolo con una película de plástico.
El objetivo principal de este estudio es desarrollar un método fácil de usar utilizando un teléfono inteligente para medir las concentraciones de NS1. Este enfoque podría utilizarse como un dispositivo de pruebas en el punto de atención (POCT, por sus siglas en inglés) tanto en el hogar como en entornos clínicos. Dado el amplio rango de concentraciones de NS1 en el suero de los pacientes, se emplearon modelos lineales simples basados en los resultados de estos experimentos. Para cada concentración de NS1, se preparó un conjunto de datos compuesto por tres dispositivos de prueba. Las fotos de los dispositivos se capturaron con un teléfono inteligente en condiciones de iluminación estándar y óptimas, lo que eliminó la necesidad de una caja oscura. La zona de prueba de los PAD contiene el anticuerpo monoclonal NS1 contra el dengue de ratón, mientras que la zona de control presenta el anticuerpo IgG anti-ratón de cabra. Con un formato de ensayo sándwich, las concentraciones más altas de NS1 en las muestras corresponden a una mayor intensidad del color rojo en la zona de prueba. Por el contrario, la intensidad del color en la zona de control permanece relativamente constante. La Figura 1B muestra imágenes de teléfonos inteligentes sin procesar, que proporcionan una observación visual ventajosa sin necesidad de equipos especializados.
Utilizando una aplicación móvil dedicada, normalizamos las intensidades y calculamos modelos lineales simples para las concentraciones de NS1 con picos en muestras de suero, el coeficiente de correlación (r2) obtenido de la aplicación móvil. El coeficiente de correlación (r2) obtenido de la aplicación móvil fue de 0,92 (Figura 3), alineándose con las expectativas. Este enfoque basado en teléfonos inteligentes superó la observación a simple vista, mejorando significativamente la sensibilidad en un 178%. Además, se calcularon el límite de blanco (LoB), el límite de detección (LoD) y el límite de cuantificación (LoQ) para las intensidades normalizadas, como se presenta en la Tabla 1.
Se utilizaron muestras clínicas del mundo real para demostrar la funcionalidad práctica de los DEN-NS1-PAD en entornos clínicos. El inmunoensayo en papel produjo lecturas cualitativas de color en 20-30 minutos, lo que permitió la determinación visual de resultados negativos o positivos. Se sometieron al dispositivo muestras de suero de pacientes con sospecha de dengue. La Figura 4 ilustra y compara los resultados obtenidos tanto del dispositivo como de una prueba de diagnóstico rápido (PDR) comercial. La Tabla 2 resume los resultados de las lecturas visuales y el sistema basado en teléfonos inteligentes. La PDR comercial y el dispositivo arrojaron resultados similares, con siete resultados positivos y 23 negativos de la lectura visual. Por el contrario, el sistema de lectura basado en teléfonos inteligentes aplicado exclusivamente al dispositivo informó nueve resultados positivos y 21 negativos de las muestras clínicas.
Figura 1: Imágenes del DEN-NS1-PAD diseñado y fabricado. (A,B) Se diseña un solo canal de la barrera hidrofóbica con patrón de cera y se representa en tres estados (C) antes y (D,E) después de introducir la solución de muestra en el área designada y mostrar los resultados (D) negativos y (E) positivos, respectivamente. La solución de muestra atraviesa el canal (ver flecha etiquetada), interactuando con los componentes en ubicaciones clave: AuNPs-Ab en el área conjugada, anticuerpo anti-NS1 en el área de prueba (indicativo de un resultado positivo de dengue NS1) e IgG anti-ratón en el área de control. Los resultados son fácilmente observables a simple vista y se pueden cuantificar mediante el procesamiento de imágenes utilizando un escáner plano o la cámara de un teléfono inteligente. Abreviatura: AuNPs-Ab = conjugado nanopartículas de oro-anticuerpo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Capturas de pantalla de la pantalla del teléfono desde la aplicación móvil. (A) Pantalla de usuario de la aplicación Android que se ejecuta en el dispositivo de teléfono móvil, (B) visualización de la pantalla de la aplicación, (C) menú principal de la aplicación que los usuarios pueden seleccionar para usar la cámara o cargar imágenes de la galería, (D) visualización de una imagen relacionada para la prueba, (E) visualización del tiempo de cuenta regresiva para analizar, (F) visualización de los resultados de la prueba, incluida la intensidad de la prueba y la zona de control, la decisión de infección (positiva/negativa) y la concentración de NS1 en la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Curva de calibración lineal para la detección de NS1 en suero. Se utilizó el dispositivo y se interpretaron las imágenes mediante el procesamiento a través de una aplicación basada en datos de teléfonos inteligentes. Las barras de error muestran ±1 desviación estándar, n = 3. Abreviaturas: T = área de prueba; C = área de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imagen de DEN-NS1-PAD del ensayo de la muestra clínica. Se utilizó suero (50 μL) en un inmunoensayo basado en papel. (A) Ejemplo de resultado negativo, (B) resultados positivos, (C) resultados generales y comparación de RDT versus inmunoensayo en papel. Abreviaturas: RDT = Prueba de Diagnóstico Rápido; Pos = positivo; Neg = negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetro | A simple vista | Aplicación móvil |
| Límite de espacio en blanco (LoB) | - | 43.15 ng mL-1 |
| Límite de detección (LoD) | 200 ng mL-1 | 112.19 ng mL-1 |
| Límite de cuantificación (LoQ) | - | 373.58 ng mL-1 |
Tabla 1: LoB, LoD y LoQ de ImageJ y aplicación móvil sobre el estándar de calibración de datos NS1 en suero. Abreviaturas: LoB = límite de espacio en blanco; LoD = límite de detección; LoQ = límite de cuantificación.
| Paciente No. | A simple vista | Aplicación para teléfonos inteligentes | ImagenJ | |
| RDT | Inmunoensayo en papel | |||
| 1 | - | - | - | - |
| 2 | - | - | - | - |
| 3 | - | - | - | - |
| 4 | - | - | - | - |
| 5 | - | - | - | - |
| 6 | - | - | - | - |
| 7 | - | - | - | - |
| 8 | - | - | - | - |
| 9 | + | + | + | + |
| 10 | - | - | + | + |
| 11 | - | - | - | - |
| 12 | + | + | + | + |
| 13 | - | - | - | - |
| 14 | - | - | - | - |
| 15 | - | - | - | - |
| 16 | + | + | + | + |
| 17 | + | + | + | + |
| 18 | - | - | - | - |
| 19 | - | - | - | - |
| 20 | - | - | - | - |
| 21 | + | + | + | + |
| 22 | + | + | + | + |
| 23 | - | - | - | - |
| 24 | + | + | + | + |
| 25 | - | - | - | - |
| 26 | - | - | - | - |
| 27 | - | - | - | - |
| 28 | - | - | - | - |
| 29 | - | - | - | - |
| 30 | - | - | + | + |
Tabla 2: Comparación de los resultados de la lectura visual y del sistema de lectura basado en teléfonos inteligentes para muestras de suero. (+) y (-) indican interpretaciones positivas y negativas de los resultados, respectivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uno de los parámetros de diseño importantes para un sistema de lectura basado en teléfonos inteligentes es la capacidad de proporcionar un procesamiento de imágenes reproducible de muestras. En este estudio, por simplicidad y conveniencia, las imágenes se capturaron desde tres marcas diferentes de teléfonos inteligentes con cámaras de 12-13 MP sin usar una caja de imágenes o accesorios. Las condiciones variables de captura de imágenes, como la resolución de la cámara, el tiempo de captura de imágenes, las condiciones de iluminación y el entorno, pueden influir en la intensidad del color de los puntos de prueba y control del dispositivo. El impacto de los diferentes tiempos de captura de imágenes en la iluminación y el secado de PAD en las intensidades de señal de los dispositivos se minimizó mediante el uso de las intensidades de señal normalizadas, que se mantuvieron consistentes en todas las imágenes capturadas en varios momentos36. La sustracción de la señal de fondo surgió como una estrategia para mejorar la precisión de las mediciones de intensidad de color, mitigando eficazmente la influencia de las condiciones de iluminación. Nuestro hallazgo se alinea con investigaciones previas que destacan la eficacia de las técnicas de sustracción de línea de base o de fondo para minimizar los efectos ambientales39,40.
El debate actual en torno a la superioridad del uso de una caja de imágenes o un método sin accesorios tiene implicaciones para el procesamiento de imágenes39,41. Una caja de imágenes puede mejorar la solidez de los resultados del procesamiento de imágenes al minimizar las variaciones en las condiciones de imágenes 41,42,43. En este estudio, utilizamos una aplicación móvil basada en el aprendizaje automático en la nube para el procesamiento de imágenes. Este enfoque aprovecha el aprendizaje automático dentro de una plataforma basada en la nube para clasificar, extraer y enriquecer los datos de imagen automáticamente. La aplicación identificó y procesó de manera efectiva la región de interés dentro de las imágenes, abarcando las zonas de fondo, prueba y control. Este paso fue fundamental para diferenciar entre estas zonas38. Investigaciones previas sugieren que el procesamiento de imágenes que involucra el aprendizaje automático produce una clasificación superior entre los resultados de las muestras de control y de prueba 43,44,45. En este estudio, el empleo de la ubicación fija y la sustracción de fondo generó una señal de fondo consistente de los μPADs de celulosa, mejorando la consistencia y la precisión de clasificación de las lecturas proporcionadas por la aplicación móvil40,43.
En cuanto a los rendimientos consistentes en la demostración de un inmunoensayo basado en papel, el método de fabricación juega un papel importante. En un estudio previo36, se estudiaron varias condiciones de optimización para el método de diseño y fabricación de DEN-NS1-PAD, como las concentraciones de PLL, la sustancia bloqueante y el anticuerpo NS1. El dispositivo probó con éxito NS1 en tampón, cultivo celular y suero humano tanto cualitativa como cuantitativamente.
Los efectos de matriz derivados de los componentes del suero pueden interferir con el límite de detección del dispositivo cuando se analizan muestras de suero. Sin embargo, los resultados indican que el inmunoensayo desarrollado pudo detectar con éxito las concentraciones de NS1 en muestras de suero, produciendo resultados comparables a los de la PDR comercial (Tabla 2). Se observaron los resultados aparentes utilizando la inspección visual y la aplicación móvil (Figura 4), lo que subraya la eficacia del ensayo para las pruebas de suero. Si bien la mayor viscosidad del suero puede afectar los tiempos de análisis, no dificulta la interpretación de los resultados36. El uso de una aplicación móvil puede proporcionar resultados más positivos para los ensayos de muestras, ya que el uso de una aplicación móvil mejora significativamente la sensibilidad de las pruebas de muestras46. Vale la pena señalar que se necesitan más comparaciones con ensayos moleculares como la RT-PCR 15,47,48 para el dengue NS1 para determinar posibles resultados falsos positivos o falsos negativos.
Una limitación notable de este estudio surge cuando se considera una matriz de muestra más compleja como la de la sangre. De hecho, los componentes presentes en la sangre podrían interferir con el límite de detección del dispositivo. En tales casos, el empleo de almohadillas absorbentes adicionales para mejorar la absorción del tampón de funcionamiento representa una solución potencial. Esta modificación puede ayudar a la coagulación de la sangre, aprovechando las propiedades hemostípicas de la celulosa al influir en las plaquetas de la sangre49. Otro enfoque consiste en aplicar gotas de solución salina al 4% (p/v) en la almohadilla de muestra para mejorar la coagulación de la sangre. Investigaciones previas han demostrado que sales como el cloruro de calcio y el cloruro de sodio inducen la coagulación de los glóbulos rojos (RBC)50,51. El Na+ puede desestabilizar la suspensión de los glóbulos rojos en la sangre suprimiendo la doble capa eléctrica en la superficie de los glóbulos rojos y reduciendo la repulsión de carga entre los glóbulos rojos. Además, una alta concentración de sal también induce la agregación sanguínea52. Además, la carga de valencia de contraiones del Na+ suprime el espesor de la doble capa cargada de glóbulos rojos, lo que conduce a la agregación de los glóbulos rojos desinflados. La adición de solución salina (NaCl) al 4% (p/v) facilita la separación del plasma en papel de celulosa51. Sin embargo, es necesaria una optimización cuidadosa de la concentración salina para evitar inducir efectos indeseables sobre la agregación sanguínea y la agregación de nanopartículas de oro53,54.
Las impresoras de cera comerciales proporcionaron una combinación ideal de costo y simplicidad de creación de prototipos. Como estas impresoras se suspendieron en 2016, se requirieron métodos de fabricación alternativos, como la impresión por inyección de tinta55, la serigrafía56 y la fotolitografía57. Una impresora de tóner de oficina es una buena candidata para la fabricación de μPAD. La resina de poliéster del tóner crea patrones hidrófobos a 200 °C durante 60 min con varios diseños58.
En esta investigación se utilizó el anticuerpo NS1 serotipo dos, según lo especificado por la empresa. Sin embargo, encontramos que este anticuerpo también interactúa con todos los serotipos36,37. Las sensibilidades para la detección de DENV-4 son menores (87,5%) en comparación con otros serotipos. La sensibilidad de DENV-1 y DENV-2 es de aproximadamente 88,89%, y para DENV-3 es de 100%37. Estos hallazgos se alinean con investigaciones anteriores, que también informaron una menor sensibilidad de la PDR al DENV-4 en comparación con otros serotipos59. La sensibilidad general del dispositivo es de ~88,89%, con una especificidad de aproximadamente 86,67%. Cabe destacar que la sensibilidad real de DEN-NS1-PAD puede superar a la de la RDT comercial. Sin embargo, la PDR demuestra un valor predictivo positivo (VPP) del 84,62% y una precisión del 87,67%. Cabe destacar que el DEN-NS1-PAD tuvo un mejor desempeño en la detección de la infección por dengue en los primeros 5-6 días, mientras que la PDR es efectiva solo en los primeros 5 días37.
En resumen, la combinación de un inmunoensayo portátil en papel (DEN-NS1-PAD) con una aplicación para teléfonos inteligentes es muy prometedora para la medición del dengue NS1. La aplicación móvil mejora significativamente la sensibilidad y la eficiencia en la cuantificación de NS1 en muestras de suero en comparación con la observación a simple vista. Los beneficios de la aplicación móvil incluyen la reducción del tiempo de análisis, la facilidad de uso y la compatibilidad con diversos dispositivos de teléfonos inteligentes, posiciones y condiciones de iluminación. Sin embargo, se necesitan más mejoras para mejorar la sensibilidad y el rendimiento. Mientras tanto, es necesaria la modificación del inmunoensayo basado en papel para mejorar su rendimiento cuando se trata de muestras de sangre. Además, se requieren evaluaciones exhaustivas del DEN-NS1-PAD para detectar el dengue utilizando un número más significativo de serotipos de infección primaria y muestras seleccionadas recolectadas de varios pacientes (niños y adultos).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
M.H.P. agradece el fondo de investigación de becas de la Universitas Islam Indonesia (UII). Los autores expresan su gratitud al Sr. Nutchanon Ninyawee por su valiosa experiencia y asistencia a lo largo del desarrollo de la aplicación móvil y sus contribuciones al manuscrito. Además, los autores agradecen el apoyo financiero brindado por Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Fondo de Investigación Básica: Año fiscal 2023 (proyecto no. FRB660073/0164) en el marco del Programa de Atención Sanitaria Inteligente de la Universidad Tecnológica Rey Mongkut de Thonburi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10x30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
References
- Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
- World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , WHO, Geneva. 1-34 (2012).
- WHO Dengue and severe dengue. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
- Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
- Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
- Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570 (2014).
- Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
- Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102 (2015).
- Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673 (2017).
- Lin, C. -F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
- Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
- Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409 (2013).
- Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341 (2013).
- Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
- World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control -- New edition. , https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789241547871 (2009).
- Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
- Kim, S. -W., Cho, I. -H., Lim, G. -S., Park, G. -N., Paek, S. -H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
- Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
- Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V.
- Hu, J., et al.
- Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
- Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
- Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
- He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
- Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
- Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104 (2018).
- Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
- Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D.
- Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1 (2015).
- Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
- Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678 (2012).
- Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
- Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291 (2017).
- You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
- Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
- Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
- Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. Prabowo, M. H., et al. , 1901000816 (2019).
- Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
- Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800 (2020).
- Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
- Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203 (2017).
- Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84 (2017).
- Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
- Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7 (2019).
- Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391 (2018).
- Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
- Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
- Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
- Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
- Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376 (2014).
- Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
- Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
- Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
- Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
- Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
- Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).
