Eine optimierte Reverse-Poly-Transfektionstechnik auf Basis embryonaler Stammzellen der Maus zur schnellen Erforschung von Nukleinsäureverhältnissen

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur umgekehrten Polytransfektion von embryonalen Stammzellen der Maus während der Kultur mit 2i- und LIF-Medien. Diese Methode bietet eine höhere Durchführbarkeit und Effizienz als herkömmliche Vorwärtstransfektionsprotokolle und ermöglicht gleichzeitig eine Ein-Topf-Optimierung der Plasmidverhältnisse.

Abstract

Aufgrund ihrer relativen Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit ist die transiente Transfektion von Säugetierzelllinien mit Nukleinsäuren zu einer tragenden Säule in der biomedizinischen Forschung geworden. Während die meisten weit verbreiteten Zelllinien robuste Protokolle für die Transfektion in adhärenten zweidimensionalen Kulturen haben, lassen sich diese Protokolle oft nicht gut auf weniger untersuchte Linien oder solche mit atypischen, schwer zu transfizierenden Morphologien übertragen. Unter Verwendung von pluripotenten Stammzellen der Maus, die in 2i/LIF-Medien, einem weit verbreiteten Kulturmodell für die regenerative Medizin, gezüchtet wurden, skizziert diese Methode ein optimiertes, schnelles umgekehrtes Transfektionsprotokoll, das eine höhere Transfektionseffizienz erreichen kann. Unter Nutzung dieses Protokolls wird eine Polytransfektion mit drei Plasmiden durchgeführt, wobei die überdurchschnittlich hohe Effizienz bei der Plasmidabgabe genutzt wird, um einen erweiterten Bereich der Plasmidstöchiometrie zu untersuchen. Dieses umgekehrte Polytransfektionsprotokoll ermöglicht eine experimentelle Eintopfmethode, die es den Anwendern ermöglicht, die Plasmidverhältnisse in einem einzigen Well zu optimieren, anstatt über mehrere Co-Transfektionen hinweg. Durch die schnelle Erforschung der Auswirkungen der DNA-Stöchiometrie auf die Gesamtfunktion der gelieferten genetischen Schaltkreise minimiert dieses Protokoll den Zeit- und Kostenaufwand für die Transfektion embryonaler Stammzellen.

Introduction

Die Verabreichung von DNA und RNA in Säugetierzellen dient als Kernpfeiler der biomedizinischen Forschung¹. Eine gängige Methode zur Einführung exogener Nukleinsäuren (NA) in Säugetierzellen ist die transiente Transfektion ^2,3. Diese Technik beruht auf dem Mischen von NA mit kommerziell erhältlichen Transfektionsreagenzien, die in der Lage sind, sie in die Empfängerzellen zu bringen. Typischerweise wird NA durch Vorwärtstransfektion abgegeben, bei der Zellen, die an einer zweidimensionalen Oberfläche haften, den Transfektionskomplex erhalten. Während die Vorwärtstransfektion für die gängigsten etablierten Zelllinien robust ist und die Protokolle gut veröffentlicht sind, lassen sich Nischenzelltypen mit Nicht-Monolayer-Morphologien nicht leicht transfizieren, was die Menge an NA, die abgegeben werden kann, und die Anzahl der Zellen, die sie erhalten, begrenzt.

Pluripotente Stammzellen (PSCs) dienen als attraktives Modell für das Verständnis der Entwicklung und als Werkzeug für die regenerative Medizin, da sie sich unbegrenzt teilen und jeden Körperzelltyp produzieren können. Bei Maus-PSCs (mPSCs) behalten routinemäßige In-vitro-Kulturbedingungen mit 2 Inhibitoren und LIF (2i/LIF) eine kuppelartige Koloniemorphologie bei, die die Anzahl der Zellen, die einer Vorwärtstransfektion ausgesetzt sind, direkt begrenzt ^4,5,6. Um dies zu beheben, kann eine umgekehrte Transfektion durchgeführt werden: Zellen werden in eine Schale gegeben, die Medien und Transfektionsreagenz enthält, anstatt Transfektionsreagenz zu adhärenten Zellen^{hinzuzufügen 7}. Dies erhöht zwar die Anzahl der Zellen, die dem Reagenz ausgesetzt sind, erfordert aber auch, dass die Zellen gleichzeitig durchgelassen und transfiziert werden.

Über einfache Einzel-NA-Transfektionen hinaus zielen Forscher oft darauf ab, mehrere NA-Konstrukte in vitro in eine Zellpopulation einzubringen. Dies wird typischerweise durch eine Co-Transfektion erreicht, bei der die NAs in einem bestimmten Verhältnis (1:1, 9:1 usw.) gemischt und dann mit dem gewählten Transfektionsreagenz⁸ kombiniert werden. Dies ergibt eine Mischung aus NAs und Reagenzien, die das ursprüngliche Verhältnis von NAs zueinander beibehält - während die Zellen in der Behandlung unterschiedliche Mengen dieser Mischung erhalten können, erhalten sie alle das gleiche Verhältnis⁹. Dies ist zwar von Vorteil, wenn das gewünschte Verhältnis der Teile bekannt ist, aber die Bestimmung dieses Verhältnisses im Voraus kann arbeitsintensiv sein, da jedes Verhältnis eine andere Bedingung darstellt. Eine Alternative besteht darin, eine "Polytransfektion" durchzuführen, bei der einzelne NAs unabhängig voneinander mit dem Transfektionsreagenz gemischt werden⁹. Durch die Kombination von Transfektionskomplexen, die einzelne NAs enthalten (anstatt NAs zu kombinieren, bevor die Komplexe erstellt werden), können Forscher eine breite Palette von NA-Stöchiometrien in einem einzigen Transfektionsexperiment untersuchen⁹. Dies ist besonders wertvoll in Fällen, in denen erwartet wird, dass die Produkte mehrerer NAs miteinander interagieren, wie z. B. bei induzierbaren Transkriptionssystemen oder Systemen mit in ^1,10,11 eingebauter Rückkopplung. Um dies effektiv zu tun, ist jedoch eine hohe Transfektionseffizienz erforderlich. In der Tat nimmt mit zunehmender Anzahl einzigartiger transfizierter NAs die Wahrscheinlichkeit, dass eine bestimmte Zelle alle gewünschten NAs erhält, exponentiell ab ^9,12.

Der folgende Bericht beschreibt ein reverses Transfektionsprotokoll für mPSCs unter Verwendung eines kationischen Transfektionsreagenzes auf Lipidbasis, bei dem die Zellen maximal 5 Minuten lang dem Reagenz-NA-Mix ausgesetzt werden, um die Lebensfähigkeit zu maximieren und die Zeit außerhalb typischer Kulturbedingungen zu minimieren. Der Vergleich dieses Protokolls mit der Standard-Vorwärtstransfektion dieser Zellen zeigt eine höhere Transfektionseffizienz und eine Erhöhung der Gesamtzahl der überlebenden transfizierten Zellen. Durch die Kombination dieser umgekehrten Transfektion mit einer Drei-Plasmid-Polytransfektion unter Einbeziehung einfacher fluoreszierender Reporter wird ein erweitertes Potenzial für das Screening von NA-Verhältnissen mit hoher Transfektionseffizienz demonstriert.

Protocol

1. Vorbereitung von Reagenzien für die mPSC-Kultur

1. N2-Ergänzung vorbereiten.
   1. Unter nicht sterilen Bedingungen werden die folgenden Stammlösungen (Schritt 1.1.1.1) in einem chemischen Sicherheitsabzug hergestellt. Geben Sie das feste Pulver jeder Chemikalie in ein vorgewogenes konisches 50-ml-Röhrchen. Wiegen Sie jedes Röhrchen nach Zugabe des Pulvers und fügen Sie eine angemessene Menge Lösungsmittel hinzu, um die folgenden Konzentrationen zu erreichen. Bereiten Sie für einen Medienstapel die angegebene Mindestmenge vor.
      HINWEIS: Die folgenden Reagenzien sind gefährlich und sollten in Übereinstimmung mit den örtlichen Chemikaliensicherheitsrichtlinien gehandhabt werden. Achten Sie bei der Handhabung auf die richtige PSA und arbeiten Sie nur mit den festen Pulverformen dieser Chemikalien in einem chemischen Abzug, um ein Einatmen zu verhindern.
      1. Mindestens 0,05 ml Natriumselenit in Wasser bei 0,518 mg/ml, 0,5 ml Putrescin in Wasser bei 160 mg/ml, 0,165 ml Progesteron in 100% Ethanol bei 0,6 mg/ml (siehe Materialtabelle).
      2. Lagern Sie Lösungen bis zu 2 Jahre bei -20 °C.
   2. In einer Biosicherheitswerkbank (BSC) fügen Sie Folgendes zu 58,035 ml DMEM-F12 hinzu.
      1. 0,05 ml einer 0,518 mg/ml Natriumselenitlösung, 0,5 ml einer 160 mg/ml Putrescinlösung, 0,165 ml einer 0,6 mg/ml Progesteronlösung.
      2. Filter Sterilisieren Sie die obige Mischung mit einem 0,22-μm-Filter.
   3. Bereiten Sie immer noch in der BSC eine 100 mg/ml-Lösung von Apotransferrin vor.
      1. Fügen Sie 5 ml DMEM-F12 zu 500 mg Apotransferrin hinzu (siehe Materialtabelle). Den Behälter langsam wieder aufhängen und waschen, Blasen vermeiden.
      2. Nachdem Sie es mit 5 ml resuspendiert und so viel wie möglich entfernt haben, fügen Sie es der Selenit/Putrescin/Progesteron-Lösung hinzu. Nehmen Sie mehr von der vorherigen Lösung und waschen Sie die Apotransferrinflasche, um so viel wie möglich davon herauszuholen.
   4. Geben Sie 5 ml 7,5 % BSA-Fraktion V (siehe Materialtabelle) in die Lösung.
   5. Mischen und aliquotieren Sie 6,875 ml pro Röhrchen. Aliquote bis zu 1 Jahr bei -80 °C lagern.
   6. Wenn Sie die oben genannten N2-Aliquots zur Herstellung von N2B27-Medien verwenden, tauen Sie das gewünschte Aliquot auf und fügen Sie 3,125 ml einer 4 mg/ml-Insulinlösung (siehe Materialtabelle) zu den 6,875 N2 hinzu, um 10 ml 100x N2 zu erhalten.
2. Bereiten Sie N2B27-Basalmedien vor.
   1. Tauen Sie N2- und B27-Ergänzungen einige Stunden oder über Nacht in einem 4 °C-Kühlschrank auf.
   2. Mischen Sie in einer BSC 484,5 ml DMEM-F12 und 484,5 ml neurobasales Medium (siehe Materialtabelle) in einer sterilen 1-l-Flasche.
   3. Fügen Sie dem Medium 10 ml B27 und 10 ml N2-Ergänzung hinzu.
   4. Fügen Sie 1 ml 55 mM Beta-Mercaptoethanol hinzu (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 10 ml 100x Glutamax hinzu. Mischen Sie kräftig, indem Sie die Flasche schwenken.
   5. Aliquotieren Sie das gewünschte Volumen pro Aliquot (typischerweise 100 ml) und lagern Sie es bis zu 1 Jahr bei -80 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C bis zu 3 Wochen im Gebrauch lagern.
3. Bereiten Sie NBiL-Medien vor.
   1. Tauen Sie ein 100-ml-Aliquot von N2B27-Basalmedien bei -80 °C im 4 °C-Kühlschrank auf.
   2. In einer BSC wird LIF (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/l hinzugefügt.
   3. Fügen Sie CHIR99021 (3 μM endg.) und PD0325901 (1 μM endg.) hinzu (siehe Materialtabelle). Mit einer serologischen 50-ml-Pipette gut mischen. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern.
4. Bereiten Sie 0,2% ige Gelatinelösung vor.
   1. 500 ml doppelt destilliertes H₂O in eine 1-Liter-Glasflasche umfüllen.
   2. Messen Sie 1 g Gelatine ab (siehe Materialtabelle) und geben Sie sie in das Wasser. Mischen Sie, indem Sie die Flasche schütteln, bis sie sich weitgehend aufgelöst hat.
   3. Autoklavieren Sie die Gelatine-Wasser-Mischung bei 15 psi, 121 °C für 35 min. Nach dem Abkühlen mit einem 0,22-μm-Filter in einem BSC filtern. Bei 4 °C lagern.
5. Waschmedien vorbereiten.
   1. Mischen Sie in einem BSC 160 μl 7,5 % BSA pro 10 ml DMEM-F12.
   2. Skalieren Sie die oben genannten und bereiten Sie sie in großen Mengen für eine einfache zukünftige Verwendung vor (z. B. 8 ml 7,5 % BSA auf 500 ml DMEM-F12). Bei 4 °C lagern.

2. Vorbereitung von Reagenzien für die mPSC-Polytransfektion

HINWEIS: Die folgenden Werte gelten für eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Platte. Die Werte können entsprechend skaliert werden. Die Sequenzen aller DNA/Plasmide sind in der Zusatzdatei 1 detailliert beschrieben.

1. Berechnen Sie das Volumen der DNA-Lösung, die pro Behandlung benötigt wird.
   1. Bereiten Sie 500 ng DNA pro Well/Zustand vor.
      1. Wenn ein einzelnes Plasmid mit einer DNA-Lösung von 100 ng/μl transfiziert wird, bereiten Sie ein Röhrchen mit 5 μl DNA vor.
      2. Wenn zwei Plasmide mit jeweils 100 ng/μl transfiziert werden, bereiten Sie zwei Röhrchen mit jeweils 2,5 μl vor, eines für jedes Plasmid.
2. Führen Sie in einer BSC Folgendes durch: Aliquotieren Sie für jede 500-ng-Transfektionsbehandlung (siehe Materialtabelle) 25 μl OptiMEM in ein 1,5-ml-Röhrchen.
   1. Skalieren Sie dies entsprechend - für das obige Beispiel bereiten Sie zwei Röhrchen mit jeweils 250 ng DNA (2,5 μl) und 12,5 μl OptiMEM vor.
3. Geben Sie das erforderliche DNA-Volumen für diese Behandlung in das OptiMEM im Röhrchen.
4. Stellen Sie für jedes Röhrchen mit 500 ng DNA und OptiMEM ein passendes Röhrchen mit weiteren 25 μl OptiMEM und 1 μl kationischem Transfektionsreagenz auf Lipidbasis her.
   1. Auch diese Werte müssen entsprechend skaliert werden. Bereiten Sie für das obige Beispiel zwei Röhrchen mit jeweils 12,5 μl OptiMEM und 0,5 μl Transfektionsreagenz vor.
      HINWEIS: Verwenden Sie beim Skalieren von Werten die Masse der hinzugefügten DNA, nicht das Volumen, das für diese DNA-Menge erforderlich ist. Reaktionen mit Transfektionsreagenz und DNA können skaliert werden (z. B. wenn 5 Wells mit derselben DNA transfiziert werden sollen). Lassen Sie die Verhältnisse der Reagenzien gleich, skalieren Sie jedoch entsprechend (z. B. 1000 ng DNA: 50 μl OptiMEM: 2 μl Transfektionsreagenz: 50 μl OptiMEM).

3. Vorbereitung von mPS-Zellen für die Transfektion

HINWEIS: Bereiten Sie für die umgekehrte Transfektion das Kulturgefäß vor und passieren Sie die mPSCs direkt, bevor Sie die Transfektionsreagenzien hinzufügen. Für die Vorwärtstransfektion die Zellen 12-18 Stunden vor der Transfektion durchlassen und plattieren, damit die Zellen an der Platte haften können.

1. Bereiten Sie ein mit 0,2 % gelatinebeschichtetes Zellkulturgefäß vor.
   1. Planen Sie die Anzahl der für die Transfektion benötigten Wells (ein Well einer 24-Well-Platte pro Behandlung/Gruppe).
   2. Geben Sie 200 μl der 0,2%igen Gelatinelösung in jede der gewünschten Vertiefungen in der 24-Well-Platte.
   3. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen, und stellen Sie sicher, dass sie den gesamten Boden der Vertiefung bedeckt.
   4. Lassen Sie die Vertiefungen mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur beschichten.
   5. Entfernen Sie mit einem Vakuumsauger vorsichtig alle Gelatinereste aus den Vertiefungen (kippen Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit entfernt wird, ohne die Gelatineschicht abzukratzen).
   6. Geben Sie 0,5 ml NBiL-Medien (Schritt 1.3) in jede Vertiefung und lassen Sie die Platte zum Vorwärmen in einem Gewebekultur-Inkubator.
2. Passage mPSCs.
   1. Aliquotieren Sie 30 ml Waschmedium (Schritt 1.5) in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
   2. Aspirieren Sie die alten Medien aus der Gewebekulturschale von mES-Zellen.
      HINWEIS: Mehrere Aspirationstechniken sind zulässig. Unabhängig davon, welche Technik gewählt wird, stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht über längere Zeiträume (maximal ca. 30 s) trocken bleiben.
   3. Fügen Sie die erforderliche Menge des handelsüblichen Zellentfesselungsmediums hinzu (1,5 ml für eine 10-cm-Schale, entsprechend skalieren, siehe Materialtabelle).
   4. Warten Sie 3-5 Minuten, bevor Sie 15-20 Mal mit einer P1000-Pipette auf und ab pipettieren, um eine Einzelzellensuspension zu erhalten. Betrachten Sie Zellen unter einem Mikroskop, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
   5. Übertragen Sie die Zellen im Trennmedium in das 50-ml-Röhrchen mit dem Waschmedium.
   6. Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Saugen Sie das Waschmedium an und stellen Sie sicher, dass keine Restflüssigkeit im Rohr verbleibt.
   7. Resuspendieren Sie das Pellet in einer kleinen Menge Waschmedium (~300 μl). Zählen Sie die Zellsuspension mit einem Hämozytometer, um die Zelldichte zu erhalten.

4. Rückwärtstransfektion von mPS-Zellen

1. Bereiten Sie Polytransfektionsreagenzien gemäß Schritt 2 vor.
2. Bereiten Sie das Zellkulturgefäß und die Passage-mPSCs gemäß Schritt 3 vor.
3. Aliquotieren Sie 200 μl NBiL-Medien auf 1,5 ml-Röhrchen, eines für jede Behandlung.
4. Geben Sie 26 μl des OptiMEM:Transfektionsreagenzgemisches in das DNA:OptiMEM-Gemisch. Mischen Sie die Reagenzien schnell und kräftig, indem Sie sie etwa 10 Mal pipettieren. Lassen Sie die Mischung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Übertragen Sie basierend auf der Zelldichte das erforderliche Zellvolumen von der 300-μl-Zellsuspension auf die 200-μl-NBiL-Röhrchen, um 25.000 Zellen pro Röhrchen zu erhalten.
6. Nach 5 Minuten Inkubation des Lipofectamine 2000 (L2K, Transfektionsreagenz) und der DNA-Mischung in das 1,5-ml-Zellröhrchen geben und durch Pipettieren gut mischen. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem Reagenz inkubieren.
7. Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Pipettieren Sie die Flüssigkeit heraus und lassen Sie ca. 50 μl übrig.
8. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 100 μl NBiL-Medien. Übertragen Sie die Zellen auf die Platte und legen Sie die Platte in den Inkubator. Wechseln Sie das Medium 24 h später mit frischen NBiL-Medien.

5. Vorwärtstransfektion von mPS-Zellen

1. 12-18 h vor der Transfektion das Zellkulturgefäß und die Passage-mPSCs gemäß Schritt 3 vorbereiten.
2. Übertragen Sie basierend auf der Zelldichte das erforderliche Zellvolumen aus der 300-μl-Zellmischung auf 25.000 Zellen pro Well. Legen Sie die Platte in den Inkubator.
3. 1 h vor der Transfektion das Medium aus allen Wells absaugen und durch 0,5 ml NBiL-Medium ersetzen. Legen Sie die Platte in den Inkubator.
4. Bereiten Sie zum Zeitpunkt der Transfektion mPSC-Polytransfektionsreagenzien gemäß Schritt 2 vor.
5. Geben Sie 26 μl des OptiMEM:Transfektionsreagenzgemisches in das DNA:OptiMEM-Gemisch. Mischen Sie die Reagenzien schnell und kräftig, indem Sie sie etwa 10 Mal pipettieren. Lassen Sie die kombinierte Mischung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Geben Sie die kombinierte Mischung tropfenweise in die Vertiefungen. Legen Sie die Platte in den Inkubator. Wechseln Sie das Medium 24 h später.

6. Durchflusszytometrie

1. Aspirieren Sie das Medium 48 Stunden nach der Transfektion aus der transfizierten 24-Well-Platte.
2. 200 μl Trypsin in jede Vertiefung geben, schwenken und 30 s bei 37 °C inkubieren. Klopfen Sie auf die Seiten der Platte und fügen Sie 200 μl eiskalten FACS-Puffer (2% FBS in PBS) hinzu.
3. Öffnen und beschriften Sie eine 96-Well-Platte mit V-Boden, beginnend mit A1. Mischen Sie den Inhalt jeder Vertiefung auf der transfizierten Platte, um Zellen zu entfernen, und stellen Sie Einzelzelllösungen mit einer P200-Pipette her. Übertragen Sie 200 μl aus jeder Vertiefung in die entsprechende Vertiefung auf der 96-Well-Platte.
4. Geben Sie 15 ml FACS-Puffer in ein 50-ml-Reagenzreservoir. Die Platte bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die 96-Well-Platte mit einer schnellen und gleichmäßigen Bewegung in die Spüle umdrehen.
5. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Pellets auf der 96-Well-Platte in 150 μl FACS-Puffer aus dem Reagenzreservoir zu resuspendieren. Wiederholen Sie die Schritte 6.4-6.5 zweimal. Legen Sie die 96-Well-Platte in eine mit Eis gefüllte Box, die vor Licht geschützt ist.
6. Führen Sie die Proben durch ein Durchflusszytometer, um die Populationsverteilungen der fluoreszierenden Reporter zu erhalten.
   1. Stellen Sie sicher, dass das Zytometer in Bezug auf Laser- und Filterkombinationen für das durchzuführende Experiment geeignet ist (verwenden Sie z. B. keinen Infrarot-Reporter, wenn es nicht möglich ist, im dunkelroten Spektrum anzuregen oder zu detektieren).
   2. Fügen Sie zusätzliche Proben für Standardisierungsperlen hinzu, um eine MEFL-Konvertierung der Daten während der Analyse zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass genügend Zellen pro Probe für eine angemessene statistische Analyse gesammelt werden⁹.
7. Konvertieren Sie Fluoreszenzeinheiten aus den Rohzytometerdateien und analysieren Sie die Daten mit einer von mehreren Methoden, wie z. B. Python- oder MATLAB-basierten Pipelines oder kommerziell erhältlicher Software ^9,13.

Representative Results

Sowohl Vorwärts- als auch Rückwärtstransfektionen beruhen auf der Wechselwirkung zwischen der Zellmembran und den eingehenden Transfektionsreagenz-DNA-Komplexen, die die Abgabe von NA an die Empfängerzellen ermöglichen. Wo sich diese Techniken unterscheiden, ist der Zustand der Zelle bei der Abgabe - während die DNA in der Regel bei der traditionellen Vorwärtstransfektion an adhärente Zellmonoschichten abgegeben wird, beruht die umgekehrte Transfektion stattdessen darauf, dass der Reagenz-DNA-Komplex in einer Einzelzellsuspension auf die Zellen trifft. Dieser Unterschied kann besonders in Situationen entscheidend sein, in denen Zellen nicht als gleichmäßige, flache Monoschicht wachsen und stattdessen eine gewölbte oder kolonieähnliche Morphologie annehmen, wie bei mPSCs. Zusätzliche Variationen der traditionellen Transfektion können übernommen werden, z. B. die Durchführung einer Polytransfektion anstelle einer Co-Transfektion. Diese Modifikation verändert die relative Verteilung jeder DNA-Spezies in einer bestimmten Behandlung, sodass Forscher die Beziehung zwischen Phänotyp und Dosierung ihrer Plasmide schnell untersuchen können. Bei der Durchführung dieser Experimente ist es auch wichtig, eine Standardisierung und Qualitätskontrolle des Zytometers selbst durchzuführen. Die Fluoreszenzeinheiten für mehrere der folgenden Experimente wurden auf einen Fluoreszenzperlenstandard normiert, um einen genauen Vergleich über die Versuchstage hinweg zu ermöglichen (Ergänzende Abbildung 1) gemäß den etablierten Protokollen¹³. Die Zellen wurden wie gezeigt manuell angesteuert (Ergänzende Abbildung 2).

Angesichts der Koloniemorphologie von mPSCs wären herkömmliche Vorwärtstransfektionsmethoden durch die Anzahl der Zellen begrenzt, die direkt den umgebenden Medien ausgesetzt sind. Im Vergleich zu umgekehrten Transfektionen hatten Vorwärtstransfektionen einen signifikant geringeren Anteil an Zellen, die positiv für den Marker waren (>3-fach weniger, p < 0,05, Abbildung 1A), obwohl im Durchschnitt eine nicht signifikant geringere Menge an DNA an die Zellpopulation abgegeben wurde (~1,3-fach, Abbildung 1B).

Interessanterweise beeinflusste die Inkubationszeit signifikant den Anteil der Zellen, die für den Reporter positiv waren, aber nicht die durchschnittliche Reporterexpression in den positiven Zellen (Abbildung 2A, B). Es wurde beobachtet, dass die Inkubation von Zellen für bis zu 20 Minuten den Prozentsatz der für den Reporter positiven Zellen erhöhte, wobei länger als 40 Minuten diesen Prozentsatz verringerte. Entscheidend ist, dass die Durchführung der umgekehrten Transfektion durch Zugabe des Reagenzes direkt in die Vertiefung mit passageierten Zellen die höchsten prozentualen positiven und mittleren Expressionswerte ergab, aber auch zu einer geringeren Anzahl überlebender Zellen am gewählten Endpunkt führte. Während eine Steigerung der Transfektionseffizienz bei einer Inkubation über die für dieses Protokoll empfohlenen 5 Minuten hinaus zu beobachten ist, ist Vorsicht geboten, da eine längere Störung Auswirkungen auf den Stammzellzustand und die Differenzierungsfähigkeit haben kann⁶. Um den Einfluss von Poly- und Co-Reverse- und Forward-Transfektionen auf das Gesamtwachstum von Zellen nach der Transfektion zu klären, führten wir Zellzählungen 48 Stunden nach der Transfektion durch (Abbildung 3). Sowohl bei der Poly- als auch bei der Co-Transfektion verringerte die Durchführung einer Vorwärtstransfektion die Anzahl der am gewählten Endpunkt vorhandenen Zellen im Vergleich zu umgekehrten Transfektionen signifikant. Beim Vergleich zwischen Poly- und Co-Transfektion innerhalb von Rückwärts- oder Vorwärtstransfektionen wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet.

Beim Vergleich von Vorwärts- und Rückwärtspolyfektion zeigt sich bei Rückwärtstransfektionen eine beobachtbar höhere Transfektionseffizienz (Abbildung 4A). Mit drei fluoreszierenden Reportern, die an die Zellen abgegeben werden, ist die Anzahl der dreifach positiven Zellen, die aus Vorwärtstransfektionen resultieren, signifikant geringer als bei den Rückwärtsbehandlungen. Das Ergebnis des Unterschieds in der Transfektionseffizienz ist auch in den resultierenden Verteilungen für die polytransfizierten Populationen zu sehen (Abbildung 4B). Während der Gesamtbereich der von beiden untersuchten Verhältnisse ungefähr gleich ist, fehlt bei der Vorwärtspolytransfektion die Gesamtzahl der Zellen über die Verteilung hinweg. Vergleicht man diese Bedingungen mit den Co-Transfektionen, so zeigt sich ein Unterschied in den DNA-Verhältnissen: Während die Co-Transfektion typischerweise zu einer Abgabe von etwa 1:1:1 führt, liefert die Poly-Transfektion die Reporter über einen Bereich von mehreren Log-Folds.

Bei der Betrachtung der Gesamtverteilung der DNA-Verhältnisse für eine umgekehrte Polytransfektion kann der Vorteil der erhöhten Effizienz erkannt werden (Abbildung 4B). Während sowohl die Vorwärts- als auch die Rückwärtstransfektion eine gute Darstellung von Verhältnissen ergeben, die nahe am tatsächlichen gemischten Verhältnis der DNA (1:1:1) liegen, weist die umgekehrte Bedingung einen erweiterten dynamischen Bereich von Verhältnissen auf, die gut dargestellt sind.

Abbildung 1: Vergleich der Transfektionseffizienz zwischen Vorwärts- und Rückwärtstransfektionen in embryonalen Stammzellen der Maus. Reverse transfizierte Zellen wurden 5 Minuten lang mit GFP-Vektor-Transfektions-Reagenzienkomplexen behandelt, bevor sie einmalig gewaschen und plattiert wurden. Die Effizienz wurde 48 h nach der Transfektion mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. 25.000 Zellen wurden mit 1 μl kationischem Transfektionsreagenz auf Lipidbasis und 500 ng DNA für alle Erkrankungen behandelt. (A) Vergleich der prozentualen Positivität für Zellen, die durch Rückwärts- oder Vorwärtstransfektion transfiziert wurden. GFP-positive Zellen wurden durch Gating gegen nicht transfizierte Zellen bestimmt, zusätzlich zur Identifizierung nicht transfizierter Zellen in jeder Behandlung in der gemischten Population. (B) Vergleich der mittleren Fluoreszenzintensität von Populationen von Zellen, die durch Vorwärts- oder Rückwärtstransfektion positiv für GFP transfiziert wurden. Fehlerbalken stellen den Mittelwert und 1 Standardabweichung dar. Die Daten entsprechen 3 unabhängigen Replikaten, die jeweils aus einer anderen Durchgangsnummer stammen. Signifikante Unterschiede nach zweiseitigen t-Tests sind angegeben (*p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Titration der Inkubationszeit für umgekehrte Transfektionen eines GFP-Vektors in embryonale Stammzellen der Maus. Die Zellen wurden mit 1 μl kationischem Transfektionsreagenz auf Lipidbasis und 500 ng DNA für unterschiedliche Zeiträume gemischt, bevor sie gewaschen und plattiert wurden. Die Behandlungen über Nacht bestanden darin, dass die Zellen direkt in Vertiefungen mit Transfektionsreagenzien-DNA-Komplexen plattiert wurden, mit einem Medienersatz für die Behandlung 18 Stunden später. Die GFP-Expression wurde mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. (A) Vergleich der mittleren Fluoreszenzintensität von Zellen, die positiv für einen GFP-Vektor transfiziert wurden. (B) Vergleich des Prozentsatzes der Zellen in jeder Behandlung, die den GFP-Reporter nach verschiedenen Inkubationsdauern exprimierten, mit GFP-vektorkationischen Lipid-basierten Transfektionsreagenzkomplexen. GFP-positive Zellen wurden durch Gating gegen nicht transfizierte Zellen bestimmt, zusätzlich zur Identifizierung nicht transfizierter Zellen in jeder Behandlung in der gemischten Population. Fehlerbalken stellen den Mittelwert und 1 Standardabweichung dar. Die Daten entsprechen 3 unabhängigen Replikaten, die jeweils aus einer anderen Durchgangsnummer stammen. Signifikante Unterschiede nach zweiseitigen t-Tests sind angegeben (*p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Vergleich der Abundanz zwischen Co- und Poly-Reverse- und Forward-Transfektionen. Die Zellen wurden mit 500 ng Vektor-DNA und 1 μl kationischem Transfektionsreagenz auf Lipidbasis transfiziert und 48 Stunden später für die Hämozytometer-Lebendzellzählung geerntet. Die Zellzahlen wurden auf nicht transfizierte Kontrollen normalisiert. Fehlerbalken stellen den Mittelwert und 1 Standardabweichung dar. Die Daten entsprechen 3 unabhängigen Replikaten, die jeweils aus einer anderen Durchgangsnummer stammen. Signifikante Unterschiede nach zweiseitigen t-Tests sind angegeben (*p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Drei-Reporter-Transfektion von embryonalen Stammzellen der Maus im Vergleich von Vorwärts- und Rückwärts-Poly- und Co-Transfektionstechniken. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 μl kationischem Transfektionsreagenz auf Lipidbasis und 500 ng DNA (jeweils 167 ng GFP-, RFP- und BFP-Expressionsvektoren) behandelt. 48 h später wurden die Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. (A) Anteil aller analysierten Zellen, die für alle drei Reporter positiv waren. Reporter-positive Zellen wurden durch Gating gegen nicht transfizierte Zellen bestimmt, zusätzlich zur Identifizierung nicht transfizierter Zellen in jeder Behandlung in der gemischten Population. Fehlerbalken stellen den Mittelwert und 1 Standardabweichung dar. Die Daten entsprechen 3 unabhängigen Replikaten, die jeweils aus einer anderen Durchgangsnummer stammen. Signifikante Unterschiede nach zweiseitigen t-Tests sind angegeben (*p < 0,05). (B) Verteilung der Reporterexpression innerhalb der dreifach positiven Population. BFP- und RFP-Signale wurden für jede analysierte Zelle auf GFP-Signale normalisiert und dann pro Bedingung aufgetragen, um die Verhältnisse des DNA-Vektors pro Zelle zu visualisieren. Die Plotverteilung wurde als Pseudofarbendiagramm eingefärbt, abhängig von der Dichte der Zellen in einem bestimmten Raum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Kalibrierkurve. Standardkalibrierungskurve zur Normalisierung beliebiger Fluoreszenzeinheiten im GFP-Kanal (B525_FITC_A) auf Moleküle äquivalenten Fluoresceins (MEFL). Standardkurven und Normalisierungen wurden mit einem Durchflusszytometrie-Datenanalysator erstellt und durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Beispiel für eine Gating-Strategie zur Bestimmung des prozentualen Positivs für einen einzelnen Marker. Zelldiagramme werden zunächst für Zellen über (FSC-A vs. SSC-A) und dann werden die Zellen für Dubletten (FSC-W vs. FSC-H). Prozentual positive Gates werden erzeugt, indem eine nicht transfizierte Population verwendet und so gegated wird, dass sich 1 % dieser Population innerhalb des Gates befindet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Sequenzen der DNA/Plasmide, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Ein Hauptgrund für die weit verbreitete Einführung von Transfektionsprotokollen ist ihre Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit; Diese Protokolle erfordern jedoch eine Optimierung in experimentellen Kontexten. Nicht erwähnt sind die Standardtests, die erforderlich sind, wenn zum ersten Mal versucht wird, eine neue Zelllinie zu transfizieren. Erstens ist die Wahl des Transfektionsreagenzes entscheidend, da kommerziell erhältliche Reagenzien keine Einheitsgröße sind und in der Effizienz der NA-Verabreichungsfähigkeit je nach Zelltyp variieren. Darüber hinaus müssen Tests durchgeführt werden, um die ideale Menge an NA und Transfektionsreagenz sowie deren optimales Verhältnis zu finden. Oft reicht es aus, die vom Lieferanten des Transfektionsreagenzes empfohlenen Optimierungsschritte zu befolgen, um die ideale Menge an NA und Transfektionsreagenz zu erreichen.

Wenn eine bestimmte Transfektion fehlgeschlagen ist, sollte die erste Überlegung die Eignung der verwendeten Reagenzien sein: Überlegen Sie, ob die NA validiert und sequenziert ist, ob sich die Zellen vor der Transfektion in einem optimal lebensfähigen Zustand befinden, ob das Transfektionsreagenz chargengetestet oder mit anderen zellspezifischeren Reagenzien verglichen wurde. Oft ist eine kritische Kontrolle die Aufnahme eines Vektors, der GFP exprimiert, unter der Kontrolle eines getesteten und validierten Promotors, da Promotoren oft als zellspezifisch bekannt sind, mit unterschiedlichen Stärken in verschiedenen Zelllinien¹⁴. Abgesehen von technischen Fehlern des Benutzers können nach der Optimierung eines bestimmten Transfektionsprotokolls und einer bestimmten NA große Abweichungen in den experimentellen Ergebnissen oft auf Probleme mit einem bestimmten Reagenz zurückgeführt werden.

Während die Verwendung der Polytransfektion verschiedene Arten von Eintopfexperimenten ermöglicht, die mit herkömmlichen Co-Transfektionen nicht durchführbar sind, ist sie nicht immer die eindeutig beste Wahl. In Fällen, in denen das Verhältnis mehrerer NA titriert werden muss oder in denen das Vorhandensein einer NA die anderen dosisabhängig beeinflusst, ermöglicht die Polytransfektion die Durchführung schneller Design-Build-Test-Zyklen mit NAs ^8,9. Andererseits eignen sich Polytransfektionen nicht gut für Anwendungen, bei denen keine Einzelzellanalyse, wie z. B. die Durchflusszytometrie, durchgeführt wird. In diesen Fällen kann ein Co-Transfektionsansatz zur Erzeugung einer homogenen Population wünschenswerter sein. Darüber hinaus liefern Polytransfektionen bei Zellen, die unabhängig von der Optimierung schwer zu transfizieren sind, möglicherweise keine geeignete Anzahl von Zellen über die gesamte Verteilung für die nachgelagerte Analyse, ohne das Experiment stark zu skalieren.

Schließlich tolerieren einige Zelllinien keine Transfektion, unabhängig vom Reagenz oder der Optimierung. Leider werden Berichte über solche Linien in der Regel nicht veröffentlicht, was die Informationen über die Transfektierbarkeit einer einzelnen Linie einschränkt. In solchen Fällen können andere NA-Verabreichungsmethoden erforderlich sein, wie z. B. Elektroporation oder virusvermittelte Verabreichung. Wenn möglich, eröffnen jedoch erweiterte Transfektionsprotokolle wie die oben beschriebenen umgekehrten Polytransfektionstechniken ein neues Regime für Forscher, das auf bewährten Reagenzien und Protokollen aufbaut.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056