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Biology

Mesure à molécule unique de la dynamique d’interaction des protéines dans les condensats biomoléculaires

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/66169
Automatic Translation
1,2, 1
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

Summary

Il a été démontré que de nombreuses protéines intrinsèquement désordonnées participent à la formation de condensats biomoléculaires hautement dynamiques, un comportement important pour de nombreux processus cellulaires. Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie à molécule unique pour quantifier la dynamique par laquelle les protéines interagissent les unes avec les autres dans les condensats biomoléculaires des cellules vivantes.

Abstract

Les condensats biomoléculaires formés par séparation de phase liquide-liquide (LLPS) ont été considérés comme essentiels à l’organisation cellulaire et à un nombre croissant de fonctions cellulaires. La caractérisation des LLPS dans les cellules vivantes est également importante car la condensation aberrante a été liée à de nombreuses maladies, notamment les cancers et les troubles neurodégénératifs. La LLPS est souvent pilotée par des interactions sélectives, transitoires et multivalentes entre des protéines intrinsèquement désordonnées. La dynamique d’interaction des protéines participant aux LLPS est d’un grand intérêt, car elle est bien résumée par des mesures de leur temps de séjour de liaison (RT), c’est-à-dire le temps qu’elles passent lié dans les condensats. Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie de cellules vivantes à molécule unique qui nous permet de mesurer la RT moyenne d’une protéine spécifique dans les condensats. Nous visualisons simultanément les molécules de protéines individuelles et les condensats auxquels elles s’associent, utilisons le suivi des particules uniques (SPT) pour tracer les trajectoires d’une seule molécule, puis ajustons les trajectoires à un modèle de liaison protéine-gouttelette pour extraire la RT moyenne de la protéine. Enfin, nous montrons des résultats représentatifs où cette méthode d’imagerie à molécule unique a été appliquée pour comparer les RT moyens d’une protéine à ses condensats LLPS lorsqu’elle est fusionnée et non fusionnée à un domaine oligomérisant. Ce protocole est largement applicable à la mesure de la dynamique d’interaction de toute protéine qui participe à la LLPS.

Introduction

De plus en plus de travaux suggèrent que les condensats biomoléculaires jouent un rôle important dans l’organisation cellulaire et de nombreuses fonctions cellulaires, par exemple, la régulation transcriptionnelle 1,2,3,4,5, la réparation des dommages à l’ADN 6,7,8, l’organisation de la chromatine 9,10,11,12, le chromosome X inactivation 13,14,15 et signalisation intracellulaire 16,17,18. De plus, la dérégulation des condensats biomoléculaires est impliquée dans de nombreuses maladies, notamment les cancers 19,20,21 et les troubles neurodégénératifs 22,23,24,25,26. La formation de condensats est souvent due à des interactions transitoires, sélectives et multivalentes protéine-protéine, protéine-acide nucléique ou acide nucléique-acide nucléique27. Dans certaines conditions, ces interactions peuvent conduire à une séparation de phase liquide-liquide (LLPS), une transition de densité qui enrichit localement des biomolécules spécifiques dans des gouttelettes sans membrane. De telles interactions multivalentes sont souvent médiées par les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) des protéines 1,28,29. La caractérisation biophysique de ces interactions au niveau moléculaire est essentielle à notre compréhension de nombreuses fonctions cellulaires saines et aberrantes, étant donné l’omniprésence des condensats à travers elles. Bien que les techniques basées sur la microscopie confocale à fluorescence, par exemple la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)30,31,32, aient été largement utilisées pour montrer qualitativement que les échanges moléculaires entre les condensats et l’environnement cellulaire environnant sont dynamiques, la quantification de la dynamique d’interaction de biomolécules spécifiques dans les condensats n’est généralement pas possible à l’aide de la microscopie confocale conventionnelle ou de la monomolécule microscopie sans méthodes d’analyse de données spécialisées. La technique de suivi des particules uniques (SPT) décrite dans ce protocole est basée sur la microscopie à molécule unique sur cellules vivantes33 et fournit un outil particulièrement puissant pour quantifier la dynamique d’interaction entre des protéines spécifiques dans les condensats. La lecture de SPT pour une telle mesure est le temps de séjour moyen d’une protéine d’intérêt dans les condensats.

Le protocole peut être décomposé en deux parties : l’acquisition et l’analyse des données. La première étape de l’acquisition de données d’imagerie consiste à exprimer dans les cellules une protéine d’intérêt qui est fusionnée à un HaloTag34. Cela permet de marquer la protéine d’intérêt avec deux fluorophores, où la majorité des molécules de protéines doivent être marquées avec un fluorophore non photoactivable (par exemple, JFX549 Haloligand 35) et une petite fraction d’entre elles doit être marquée avec un fluorophore photoactivable spectralement distinct (par exemple, PA-JF646 Haloligand 36). Cela permet l’acquisition simultanée de tous les emplacements des condensats dans la cellule et l’acquisition de films monomoléculaires de la protéine d’intérêt se liant et se dissociant aux condensats. Pendant ce temps, le même type de cellules est modifié pour exprimer de manière stable H2B marquée par Halo, une histone qui est en grande partie immobile sur la chromatine. Les cellules sont ensuite colorées avec le ligand PA-JF646 Halo pour permettre l’imagerie monomoléculaire de H2B. Comme nous le verrons en détail ci-dessous, cette expérience rend compte de l’apport du photoblanchiment pour permettre une quantification précise de la dynamique d’interaction de la protéine d’intérêt. Les cellules destinées aux expériences d’imagerie doivent ensuite être cultivées sur des lamelles propres, colorées avec un ou plusieurs ligands HaloTag et assemblées dans une chambre d’imagerie de cellules vivantes. À partir de là, l’échantillon est imagé sous un éclairage à feuille optique laminée et très inclinée (HILO) sur un microscope à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) capable d’imagerie à deux canaux et de détection de molécules uniques. L’émission est ensuite divisée sur deux caméras, l’une suivant les positions des condensats et l’autre les molécules individuelles. L’acquisition est réalisée avec un temps d’intégration long (de l’ordre de centaines de ms) pour brouiller les protéines à diffusion libre et ne capturer que les protéines moins mobiles en raison de leur liaison à des structures stables dans la cellule37.

La première étape de l’analyse des données consiste à utiliser un algorithme de suivi des particules uniques (SPT)38,39 pour localiser les molécules de protéines individuelles dans chaque image du film et assembler les localisations en une trajectoire pour chaque molécule au cours de sa durée de vie détectable. Les trajectoires sont ensuite triées en celles représentant les molécules à l’intérieur et celles représentant les molécules à l’extérieur des condensats en comparant les localisations des molécules tout au long de leurs trajectoires aux localisations de tous les condensats aux temps correspondants1.

Ensuite, une courbe de survie (1 - CDF) est générée en utilisant les longueurs de toutes les trajectoires dans les condensats. Le temps de séjour moyen apparent des molécules est ensuite extrait en ajustant la courbe de survie au modèle exponentiel à deux composantes suivant de liaison aux protéines,

Equation 1,

avec A comme fraction de molécules non spécifiquement liées et avec kobs,ns et kobs,s comme taux de dissociation observés des molécules non spécifiquement liées et spécifiquement liées, respectivement. Seul kobs,s est considéré à partir de maintenant. La dynamique de la dissociation des protéines, ktrue,s, et du photoblanchiment du fluorophore, kpb, contribue à kobs,s comme

Equation 2;

ainsi, pour isoler les effets de la dissociation des protéines, le taux de dissociation spécifique de H2B-Halo dans la lignée cellulaire mentionnée précédemment est mesuré.

Equation 3

H2B est une protéine qui est intégrée de manière stable dans la chromatine et qui subit une dissociation minimale dans l’échelle de temps d’acquisition d’un film à molécule unique37. Son taux de dissociation spécifique est alors égal au taux de photoblanchiment du ligand PA-JF646 Halo, ou

Equation 4.

Le temps de séjour moyen dans le condensat de la protéine d’intérêt, Equation 5, est alors

Equation 6.

Les résultats représentatifs d’Irgen-Gioro et al.40 sont présentés, où ce protocole a été appliqué pour démontrer que la fusion d’un domaine d’oligomérisation à l’IDR entraîne des temps de séjour plus longs de l’IDR dans ses condensats. Ce résultat suggère que le domaine d’oligomérisation ajouté stabilise les interactions homotypiques de l’IDR qui pilote les LLPS. En principe, la même méthode avec des protocoles légèrement modifiés peut être appliquée pour caractériser les interactions homotypiques ou hétérotypiques de toute protéine qui participe à la formation de tout type de condensats.

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Protocol

1. Marquage des protéines dans les cellules

  1. Exprimer la protéine d’intérêt fusionnée à HaloTag dans la lignée cellulaire souhaitée.
  2. Exprimer de manière stable H2B marqué Halo dans le même type de cellules que dans 1.1 en utilisant des transposons ou une transduction virale.

2. Préparation des lamelles

  1. Avant d’utiliser des lamelles pour la culture cellulaire, nettoyez-les pour éliminer les contaminants autofluorescents.
    1. Montez les lamelles de 25 mm de diamètre, #1.5 sur un support de coloration en céramique et placez-les dans un récipient en polypropylène.
    2. Immerger complètement les lamelles dans une solution de KOH à 1 M et de sonicate pendant 1 h.
    3. Rincer trois fois les lamelles avec de l’eau doublement distillée (jjdH2O).
    4. Immerger complètement les lamelles dans de l’éthanol à 100 % et du sonicate pendant 1 h.
    5. Immerger complètement les lamelles dans de l’éthanol à 20 % dilué avec du jdH2O et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.

3. Préparation des cellules pour la microscopie

REMARQUE : Effectuez les étapes de cette section dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter la contamination des cellules.

  1. Plaquez les cellules sur les lamelles nettoyées. Effectuer 2 jours avant l’imagerie si la protéine marquée Halo doit être exprimée transitoirement. Effectuer 1 jour avant l’imagerie si la protéine marquée Halo est exprimée de manière stable ou endogène.
    1. Utiliser une pince stérile pour placer les lamelles dans une plaque à 6 puits (une lamelle/puits par échantillon de cellule) et laisser l’éthanol résiduel s’évaporer.
    2. Plaquez chaque puits avec un nombre approprié de cellules pour atteindre une confluence de 70 % au moment de l’imagerie. Plaquez un puits supplémentaire avec des cellules exprimant de manière stable H2B-Halo avec la même confluence cible.
    3. Suivez cette étape uniquement si vous exprimez transitoirement la protéine d’intérêt marquée Halo. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2. Ensuite, transfectez les cellules avec le plasmide codant pour la protéine d’intérêt marquée à l’aide de réactifs de transfection appropriés et en suivant les directives du fabricant.
    4. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2.
  2. Colorer les cellules exprimant la protéine d’intérêt marquée Halo avec un ligand Halo non photoactivable (par exemple, JFX549) et un ligand Halo photoactivable (par exemple, PA-JF646). Cellules de coloration exprimant H2B-Halo avec uniquement le ligand photoactivable Halo.
    REMARQUE : Les concentrations de ligands Halo énumérées ici doivent être utilisées comme point de départ ; La concentration optimale dépendra du niveau d’expression et de la concentration locale dans le condensat de la protéine d’intérêt.
    1. Pour chaque échantillon cellulaire exprimant la protéine d’intérêt marquée Halo, diluer 100 nM JFX549 Haloligand 35 et 20 nM PA-JF646 Haloligand 36 dans 500 μL de milieu cellulaire approprié. Pour chaque échantillon exprimant H2B-Halo, diluer seulement 20 nM de ligand PA-JF646 Halo dans 500 μL de milieu cellulaire approprié.
    2. Pour chaque puits, aspirer les milieux existants, ajouter 2 mL de 1x PBS, puis aspirer le PBS (c’est ce qu’on appelle un « rinçage » pour le reste du protocole) et remplacer par des milieux contenant les ligands Halo appropriés.
    3. Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO2.
    4. Rincer avec du PBS quatre fois et remplacer par un milieu frais ne contenant pas de ligands Halo.
    5. Incuber pendant 15 min à 37 °C et 5% de CO2.
    6. Répéter les étapes 3.2.4 et 3.2.5 trois fois (quatre cycles de rinçage-incubation au total).
    7. Utilisez une pince stérile pour transférer la lamelle avec les cellules dans une chambre de lamelle de culture cellulaire compatible avec la platine du microscope.
    8. Ajouter un milieu sans rouge de phénol dans la chambre et procéder à l’imagerie. Incuber les échantillons sans les imager immédiatement à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu’à ce que cela soit nécessaire.

4. Imagerie monomoléculaire

REMARQUE : Des expériences indépendantes mesurant les temps de séjour de H2B et de la protéine d’intérêt doivent être menées sur plusieurs (≥3) jours pour générer des résultats statistiquement significatifs. Avant d’imager des échantillons de cellules au microscope, alignez les deux caméras à l’aide de microsphères colorées de 0,1 μm (Table des matériaux) ou d’un étalon d’étalonnage similaire.

  1. Préparez le microscope.
    1. Allumez le microscope et l’ordinateur qui le contrôle.
    2. Allumez les composants d’incubation des cellules vivantes (chauffage et CO2) sur le microscope et réglez-le à 37 °C et 5 % de CO2. Laissez le système s’équilibrer.
    3. Mettez une goutte d’huile appropriée sur un objectif à immersion dans l’huile TIRF 100x sur le microscope et chargez l’échantillon de cellule sur la platine du microscope.
  2. Identifiez une cellule à imager.
    1. Imagez l’échantillon de cellule sous un éclairage en fond clair et ajustez la position z jusqu’à ce que les cellules soient nettes.
    2. Identifier une cellule qui présente les caractéristiques morphologiques des cellules saines.
    3. Recadrez le champ de vision (FOV) afin qu’il ne capture que le noyau de la cellule cible.
    4. Utilisez l’éclairage laser et ajustez l’angle TIRF jusqu’à ce que l’éclairage HILO41 avec un rapport signal/bruit optimal des molécules individuelles soit atteint.
  3. Image H2B-Halo dans des cellules vivantes.
    REMARQUE : Les puissances laser utilisées dans cette section sont spécifiques à cette expérience et incluses à titre d’exemple. Les puissances laser appropriées doivent être choisies en fonction des critères énumérés dans la discussion.
    1. Configurez une configuration d’acquisition comme suit. Réglez le temps d’exposition sur 500 ms. Au cours de chaque exposition de 500 ms, excitez les molécules H2B-Halo marquées PA-JF646 avec un faisceau de 9,1 mW, 640 nm. Pendant le temps mort entre les images (158,01 μs sur le système d’imagerie utilisé ici), photoactivez les molécules avec un faisceau de 111 μW, 405 nm.
    2. Capturez 2000 images en continu avec ces paramètres. Augmenter progressivement la puissance du faisceau de 405 nm au cours de l’acquisition lorsque le nombre de molécules photoactivées devient insuffisant.
  4. Imagez la protéine d’intérêt marquée Halo dans les cellules vivantes.
    1. Utilisez un miroir dichroïque passe-long pour répartir les longueurs d’onde d’émission entre deux caméras, l’une pour détecter PA-JF646 et l’autre pour détecter JFX549. Utilisez des filtres d’émission appropriés devant les caméras.
    2. Utilisez la même configuration d’acquisition décrite dans la version 4.3.1 avec la modification suivante. Ajoutez un canal JFX549 supplémentaire pour suivre l’emplacement des condensats de protéines marqués Halo au fil du temps. Toutes les 10 s, acquérir une trame (500 ms, 2,1 mW, excitation 561 nm) dans le canal JFX549 tout en conservant l’acquisition du canal PA-JF646. Cela provoquera un saignement dans le canal PA-JF646, qui sera pris en charge dans l’analyse des données post-acquisition.
    3. Capturez 2000 images en continu avec ces paramètres. Augmenter progressivement la puissance du faisceau de 405 nm au cours de l’acquisition lorsque le nombre de molécules photoactivées devient insuffisant.

5. Analyse des données d’imagerie de molécules uniques

REMARQUE : Les paramètres utilisés dans la section 5 sont spécifiques à cette expérience et inclus à titre d’exemple. Les paramètres appropriés doivent être choisis en fonction des critères énumérés dans la discussion.

  1. Préparez les données d’imagerie brutes pour le traitement.
    1. Pour les données de la protéine d’intérêt, convertissez chaque canal du fichier de données d’imagerie brutes en un fichier .tif indépendant à l’aide d’ImageJ ou d’un logiciel de traitement d’image similaire. Pour les données de H2B, convertissez le canal unique du fichier de données d’imagerie brutes en un fichier .tif de la même manière.
      REMARQUE : Selon le logiciel d’acquisition utilisé, il peut y avoir des images vides dans le film condensat, car une seule image de suivi des condensats est prise toutes les 10 s. Les images vides doivent être remplies avec la trame condensée la plus récente (certains logiciels d’acquisition le font automatiquement). De plus, s’il y a un écoulement important du canal de condensat (JFX549) vers le canal de monomolécule (PA-JF646) pendant ces trames de suivi de condensat, les trames de monomolécule correspondantes doivent être remplacées par la trame de monomolécule la plus récente.
    2. Si des images doivent être remplacées dans l’une ou l’autre des séquences pour les raisons ci-dessus, remplacez-les par l’image la plus récente de cette séquence en modifiant (si nécessaire) et en exécutant pretracking_comb.txt, une macro ImageJ disponible dans Chong et al.1, et en suivant les invites.
  2. Générer des trajectoires de particules uniques à l’aide d’un logiciel SPT, par exemple SLIMfast39, une implémentation graphique de l’algorithme MTT38 disponible dans Teves et al.42.
    1. Chargez le fichier de la version 5.1.2 contenant le film monomolécule dans SLIMfast en cliquant sur Charger > Imagestack.
    2. Définissez les paramètres (taux d’erreur de localisation : 10-6 ; boucles de déflation : 3) pour la localisation en cliquant sur OPT > Feuille : Localisation.
    3. Définissez les paramètres (pic d’émission : 664 nm ; temps de latence : 500 ms) pour l’acquisition en cliquant sur OPT > Feuille : Acquisition.
    4. Visualisez les localisations de toutes les molécules dans un seul cadre pour vous assurer que les paramètres choisis sont appropriés (TEST LOC). Si cela n’est pas approprié, modifiez les paramètres aux étapes 5.2.2 et 5.2.3 et répétez cette étape.
    5. Générez un fichier contenant les localisations de toutes les molécules dans chaque image (LOC ALL).
    6. Chargez le fichier à partir de la version 5.2.5 dans SLIMfast en cliquant sur Charger > données de particules > SLIMfast.
    7. Définissez les paramètres (coefficient de diffusion maximal attendu : 0,1 μm2/s ; nombre maximum de concurrents : 5) pour la génération de trajectoires en cliquant sur OPT > Feuille : Suivi.
    8. Générer un fichier contenant les trajectoires de toutes les molécules (GEN TRAJ).
  3. Filtrer les trajectoires plus courtes que tmin, 2,5 s, à l’aide de evalSPT39, disponible dans Drosopoulos et al.43, pour tenir compte des erreurs de suivi qui entraînent des trajectoires artificiellement courtes.
    1. Chargez le fichier de la version 5.2.8 dans evalSPT (+ fichier > de la version 5.2.8 > OK).
    2. Définissez les paramètres (min : 5 images ; max : longueur maximale de la trajectoire pour le fichier à partir de la version 5.2.8) pour filtrer les trajectoires inférieures à 2,5 s.
    3. Générez un fichier avec toutes les trajectoires filtrées (EXPORTER LES DONNÉES).
  4. Suivez cette étape pour les trajectoires de la protéine d’intérêt uniquement. Triez les trajectoires entre celles dans les condensats et celles hors des condensats, puis extrayez le temps moyen de séjour dans les condensats.
    REMARQUE : Tous les codes de cette section sont disponibles dans Chong et al.1.
    1. Seuilz toutes les images de la vidéo acquises dans le canal JFX549 pour générer une vidéo time-lapse remplie du masque binaire évolutif dans le temps mettant en évidence les emplacements des condensats en exécutant les mask_v2.txt macro, noyau et cluster ImageJ et en suivant les invites.
    2. Reformater les trajectoires d’une seule molécule générées en 5.3.3. en utilisant le script MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, et en ajustant les noms de fichiers, les chemins et les paramètres si nécessaire. (Paramètres : exposition, 0,5 s ; Résolution, 0,16 μm/pixel).
    3. Triez les trajectoires en fonction de la fraction de la durée de vie d’une molécule donnée dans un condensat, F, à l’aide du script MATLAB, categorization_v4.m, et ajustez les noms de fichiers et les chemins si nécessaire.
    4. Procédez en utilisant uniquement des trajectoires dans les condensats.
  5. Extraire kobs,s et kpb et calculer le temps de séjour moyen corrigé, Equation 6.
    1. Extrayez kobs,s des trajectoires de la protéine dans le condensat d’intérêt à l’aide du script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, et en ajustant les noms de fichiers, les chemins et les paramètres si nécessaire.
      (Paramètres : exposition, 0,5 s ; StartFrameForFit, 5 images).
    2. Extrayez kpb des trajectoires H2B à l’aide du script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, et ajustez les noms de fichiers, les chemins et les paramètres si nécessaire.
      (Paramètres : exposition, 0,5 s ; StartFrameForFit, 5 images).
    3. Calculer le temps de séjour moyen corrigé de la protéine d’intérêt spécifiquement liée à ses condensats, Equation 6comme ,
      Equation 7
      REMARQUE : Des contrôles doivent être effectués pour vérifier que différents temps d’exposition suffisamment longs pour brouiller les particules mobiles, par exemple 300 ms et 800 ms, entraînent toujours le même temps de séjour moyen de la protéine d’intérêt.

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Representative Results

Nous présentons ici les résultats représentatifs d’Irgen-Gioro et al.40, où nous avons utilisé ce protocole SPT pour comparer la dynamique d’interaction de deux protéines dans leurs condensats LLPS auto-assemblés respectifs. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) contient un IDR qui peut subir une LLPS en cas de surexpression dans les cellules humaines. Nous avons émis l’hypothèse que la fusion de TAF15(IDR) à FTH1 (ferritine lourde 1), qui forme un oligomère à 24 sous-unités, conduirait à des interactions protéine-protéine homotypiques plus stables qui pilotent les LLPS. Pour tester cette hypothèse, nous avons exprimé transitoirement dans des cellules U2OS la fusion Halo-TAF15(IDR) ou TAF15(IDR)-Halo-FTH1 et effectué une imagerie bicolore de chaque protéine en suivant le protocole ci-dessus. Une image représentative d’une vidéo TAF15(IDR)-Halo-FTH1 est illustrée à la Figure 1A. Les molécules détectées dans le canal PA-JF646 ont été localisées et ces localisations ont été assemblées en trajectoires. Les trajectoires résultantes ont ensuite été triées entre les populations dans les condensats et hors des condensats par comparaison avec un masque binaire mettant en évidence les emplacements des condensats (figure 1B). Bien que nous ne montrions qu’une petite fraction des trajectoires pour une bonne visibilité, il existe une distinction claire entre les trajectoires des molécules liées aux condensats et liées à l’extérieur des condensats. Ensuite, une courbe de survie des longueurs de trajectoire dans les condensats a été ajustée par rapport au modèle exponentiel à deux composantes (Figure 1C). Enfin, les temps de séjour moyens après correction pour le photoblanchiment ont été extraits et tracés pour les deux protéines (figure 1D). Nous avons constaté que le temps de séjour moyen de Halo-TAF15(IDR) dans ses condensats LLPS était de 10,23 s ± 1,10 s tandis que celui de TAF15(IDR)-Halo-FTH1 était de 64,15 s ± 11,65 s. Ce résultat suggère que l’ajout du domaine oligomérisant à TAF15(IDR) stabilise effectivement la liaison protéine-condensat.

Figure 1
Figure 1 : La méthode basée sur le SPT résout les différences dans les temps de séjour des protéines dans leurs condensats. Images représentatives d’un film bicolore monomolécule de TAF15(IDR)-Halo-FTH1. Les protéines ont été marquées avec une combinaison d’une concentration plus élevée de colorant non photoactivable (100 nM JFX549, jaune) pour visualiser l’emplacement des condensats, et d’une concentration plus faible de colorant photoactivable (20 nM PA-JF646, magenta) pour visualiser les protéines individuelles, permettant la SPT. Des films dans les mêmes conditions d’imagerie ont été acquis pour Halo-TAF15 (IDR) et des films PA-JF646 à canal unique ont été acquis pour H2B-Halo. Une ligne pointillée blanche délimite le noyau. B. Image fusionnée représentative superposant un masque binaire de position des condensats (gris) et de trajectoires (multicolore). C. Courbe de survie représentative de TAF15(IDR)-Halo-FTH1 ajustée avec le modèle exponentiel à deux composantes. D. Le temps de séjour moyen de Halo-TAF15 dans était significativement plus court que celui de TAF15(IDR)-Halo-FTH1 dans leurs condensats respectifs. La valeur de chaque protéine a été calculée en moyenne à partir de 20 cellules mesurées dans des expériences indépendantes réalisées sur trois jours. L’erreur a été propagée comme erreur type de la moyenne et l’astérisque représente une différence significative dans le temps de séjour des deux protéines (p<0,05, test de Wilcoxon rank-addition). Cette figure a été adaptée avec la permission d’Irgen-Gioro et al.40. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le protocole tel que présenté ici est conçu pour des systèmes tels que ceux étudiés dans Irgen-Gioro et al.40. Selon l’application, certains éléments du protocole peuvent être modifiés, par exemple, la méthode de génération de lignées cellulaires marquées par fluorescence, le système de marquage fluorescent et le style de lamelle utilisé. Le halomarquage d’une protéine dans une cellule peut être effectué à l’aide de deux stratégies, selon celle qui convient le mieux à une expérience donnée. 1) Expression exogène : fusion de la protéine d’intérêt à un HaloTag et expression de la fusion dans une lignée cellulaire cible soit de manière transitoire par transfection, soit de manière stable à l’aide de transposons ou de transductions virales. 2) Édition du génome : frapper un HaloTag au locus du gène codant pour la protéine endogène d’intérêt dans une lignée cellulaire cible à l’aide de techniques d’édition du génome, par exemple, CRISPR44. Les avantages et les inconvénients de chacun sont discutés ailleurs45, mais brièvement, la stratégie d’expression exogène prend moins de temps mais produit une population de cellules avec une large gamme de niveaux d’expression qui sont souvent non physiologiques. La stratégie d’édition du génome prend beaucoup plus de temps, mais étiquette les protéines exprimées de manière endogène d’intérêt à leurs niveaux d’expression natifs.

De plus, ce protocole ne nécessite pas spécifiquement l’utilisation d’un HaloTag ; il est plutôt compatible avec n’importe quelle étiquette qui permet le marquage simultané d’une seule molécule et d’ensemble de la même protéine dans la cellule. Ainsi, le protocole peut être modifié pour être utilisé avec d’autres étiquettes d’auto-étiquetage comme SNAP-tag46. Enfin, des boîtes commerciales pré-nettoyées à fond de verre pour la culture cellulaire, telles que les boîtes MatTek (MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C), peuvent être utilisées à la place des chambres à lamelles à condition qu’elles soient compatibles avec l’objectif du microscope et l’huile d’immersion ; cependant, les lamelles peuvent être nettoyées plus en profondeur immédiatement avant utilisation, il est donc préférable.

Bien que les modifications ci-dessus du protocole soient facultatives, certains paramètres expérimentaux et d’analyse doivent être optimisés, à savoir les concentrations de ligands HaloTag, les puissances laser, les paramètres de localisation et de suivi, et tmin. La concentration du ligand HaloTag non photoactivable doit être choisie de manière à ce que le condensat soit marqué de manière suffisamment dense pour permettre la génération de masques. La concentration du ligand photoactivable HaloTag et la puissance du laser de photoactivation doivent être choisies de manière à ce que les molécules de protéines soient marquées et photoactivées suffisamment peu pour générer des trajectoires de qualité à une seule particule, car un excès de localisations dans chaque image entraînera une génération de trajectoire inexacte. Pour les expériences montrées dans les résultats représentatifs, il y avait généralement moins de cinq localisations par image. La puissance du laser d’excitation doit être maintenue suffisamment faible pour minimiser le photoblanchiment rapide, mais suffisamment élevée pour localiser précisément les molécules individuelles. Les paramètres de localisation et de suivi d’une molécule unique doivent être ajustés en fonction de la densité des excitations et de la dynamique de diffusion attendue de la protéine d’intérêt. Enfin, les valeurs de Equation 6 doivent être calculées sur une plage de tmin (à partir de 0 s et augmentant par incréments de temps d’exposition). Les valeurs de Equation 6 devraient converger au-dessus d’un certain seuil de tmin ; ce tmin doit être utilisé à l’étape 5.3.

La méthode décrite ici quantifie la dynamique d’interaction des protéines au sein des condensats avec une précision inaccessible aux techniques conventionnelles. De plus, il peut le faire dans des cellules vivantes avec une perturbation minimale de l’échantillon. Ceci est essentiel, car les comportements d’interaction des IDR, y compris leur formation de condensats, dépendent fortement de leur environnement local40.

Les résultats représentatifs d’Irgen-Gioro et al.40 démontrent la capacité de cette méthode à extraire les temps de séjour des protéines se liant à leurs condensats LLPS auto-assemblés. Il est important de noter que cette méthode peut être facilement étendue à n’importe quelle protéine se liant à n’importe quel type de condensats par des interactions homotypiques ou hétérotypiques. De plus, il ne se limite pas à mesurer la dynamique d’interaction des protéines subissant des LLPS. Il a été démontré que l’oncoprotéine de fusion EWS ::FLI1, qui est connue pour causer le sarcome d’Ewing, forme des centres locaux à haute concentration qui jouent un rôle essentiel dans ses fonctions d’activation transcriptionnelle et de transformation oncogénique 1,2. Bien que la formation de ces hubs soit due à des interactions IDR-IDR transitoires, sélectives et multivalentes d’EWS ::FLI1, jusqu’à présent, il n’y a toujours aucune preuve convaincante qu’il s’agit de condensats LLPS de bonne foi 1,2. Malgré cela, nous avons utilisé la méthode présentée ici pour mesurer le temps de séjour moyen d’EWS ::FLI1 à ses hubs et avons montré que la mutation de résidus spécifiques et la suppression de son IDR déstabilisaient significativement la liaison d’EWS ::FLI1 à ses hubs1.

Malgré la polyvalence de cette méthode pour caractériser la dynamique de liaison des protéines dans les condensats, il faut faire preuve de prudence lors du choix du modèle de liaison aux protéines dans des contextes spécifiques. Les données biochimiques existantes soutiennent l’idée qu’une distribution exponentielle à deux composants est souvent un modèle approprié pour de nombreux systèmes 1,37,40,42, mais la même distribution s’est également avérée être une représentation inappropriée de la liaison aux protéines dans d’autres systèmes où des modèles alternatifs tels que les distributions exponentielles à trois composants 47,48,49 et les distributions en loi de puissance 50 mieux correspondre aux observations expérimentales. Pour éviter de tirer des conclusions inexactes, il faut choisir et motiver soigneusement un modèle, vérifier que la qualité de l’ajustement soutient l’utilisation du modèle et interpréter judicieusement les résultats.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la bourse de recherche de la National Science Foundation dans le cadre de la subvention No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), la subvention de recherche de la Fondation Shurl et Kay Curci (S.C.), la subvention Merkin Innovation Seed (S.C.), la subvention de recherche Mallinckrodt (S.C.) et la bourse Margaret E. Subvention Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. est également soutenu par le NIH/NCI sous le numéro de bourse P30CA016042.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere Invitrogen T7279 Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips Marienfeld Superior 111650 Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter Semrock FF01-593/40-25 Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter Semrock FF01-676/37-25 Single-molecule imaging
6-Well TC Plate Genesee 25-105MP Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS ATCC HTB-96 Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		 Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack Thomas 24957 Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549) Janelia Research Campus Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose Gibco 10-567-022 Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope Nikon Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof Lab Alley EAP200-1GAL Preparation of coverslips
evalSPT Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum Cytiva SH30396.03 Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera Andor X-13723 Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter Semrock Di02-R635-25x36 Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit Nikon Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-20-C Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements Nikon Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin Gibco 15-140-122 Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 18912014 Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646) Janelia Research Campus Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide Mallinckrodt Chemicals 6984-06 Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system Tokai Hit Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter Cairn Research Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner Branson 5800 Preparation of coverslips

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References

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Biologie Numéro 203 Protéines intrinsèquement désordonnées dynamique de liaison aux protéines condensats biomoléculaires séparation de phase liquide-liquide suivi de particules uniques microscopie à fluorescence
Mesure à molécule unique de la dynamique d’interaction des protéines dans les condensats biomoléculaires
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Yoshida, S. R., Chong, S.… More

Yoshida, S. R., Chong, S. Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates. J. Vis. Exp. (203), e66169, doi:10.3791/66169 (2024).

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