Summary
O presente protocolo descreve o método de análise da flora intestinal utilizando o sequenciamento do gene 16S rRNA baseado em Illumina e fornece uma estrutura para avaliar a eficácia de decocções fitoterápicas.
Abstract
A fim de explorar preliminarmente os efeitos de Desmodium caudatum sobre a gastrite e flora intestinal em ratos, um modelo de gastrite crônica em ratos foi estabelecido usando o método clássico de salicilato de sódio. Dezoito ratos com FPS foram divididos em três grupos: grupo controle (Grupo C), grupo modelo (Grupo M) e grupo tratamento (Grupo T). Cortes anatomopatológicos da parede gástrica foram retirados dos ratos de cada grupo. Além disso, as concentrações de gastrina e malondialdeído no soro dos ratos de cada grupo foram determinadas por ELISA. Adicionalmente, os efeitos de D. caudatum na flora intestinal de ratos com gastrite foram explorados através de uma comparação detalhada das comunidades bacterianas intestinais nos três grupos, empregando o sequenciamento do gene 16S rRNA baseado em Illumina. Os resultados indicaram que a decocção de D. caudatum pode reduzir o conteúdo de malondialdeído e aumentar o conteúdo de gastrina. Além disso, a decocção de D. caudatum aumentou a diversidade e abundância da flora intestinal, exercendo um impacto positivo no tratamento da gastrite, regulando e restaurando a flora intestinal.
Introduction
A gastrite crônica (DC), uma das doenças clínicas mais comuns, caracteriza-se por alterações inflamatórias crônicas e persistentes no epitélio da mucosa gástrica, que é frequente e repetidamente atacado por vários fatorespatogênicos1. A taxa de incidência de CG ocupa o primeiro lugar entre todos os tipos de doenças estomacais, sendo responsável por 40% a 60% da taxa de atendimento ambulatorial do Departamento de Gastroenterologia2. Além disso, a taxa de incidência geralmente aumenta com a idade, especialmente em indivíduos de meia-idade e mais velhos3. Sem dúvida, o GC reduz significativamente a qualidade de vida das pessoas, enfatizando a necessidade crítica de descoberta de novos agentes terapêuticos.
Inúmeros estudos relatam que a ocorrência e o desenvolvimento do CG estão ligados à secreção de hormônios gastrintestinais, como a gastrina (GAS)4,5. GAS, um hormônio peptídeo gastrointestinal comum no trato digestivo, estimula as células a secretar ácido gástrico, promovendo a liberação de histamina dos eosinófilos. Além disso, melhora a nutrição e o suprimento sanguíneo da mucosa gástrica, promovendo a proliferação da mucosa gástrica e das células parietais6. Portanto, a gastrina pode ser utilizada como um indicador para avaliar o nível de desenvolvimento do GC. Além disso, produtos de peroxidação lipídica desencadeados por óxidos reativos podem ativar células inflamatórias, levando ao CG. Malondialdeído (MDA), um marcador de peroxidação lipídica, é um indicador comumente usado para medir o grau de estresse oxidativo. Reflete o nível de radicais livres na mucosa gástrica até certo ponto. O nível de MDA pode indicar o ataque de ácidos graxos insaturados na mucosa gástrica local causado por radicais livres 7,8.
A microecologia intestinal consiste em milhões de microrganismos que residem no intestino do hospedeiro, desempenhando um papel vital na manutenção da saúde do hospedeiro e na regulação da imunidade do hospedeiro. Uma flora intestinal saudável, caracterizada por alta riqueza, diversidade e função estável da microbiota, atua como barreira protetora contra a invasão de microrganismos patogênicos pela participação no metabolismo. Distúrbios na flora intestinal tornam os indivíduos mais suscetíveis a doenças gastrointestinais agudas ecrônicas9,10. Nos últimos anos, a terapia da microbiota para doenças gastrintestinais progrediu rapidamente e demonstrou eficácia significativa11. Em resumo, a consideração da flora intestinal é crucial na compreensão e abordagem das doenças gastrointestinais.
Como componente indispensável do tesouro da medicina tradicional chinesa, os materiais medicinais populares têm grande importância para a prática clínica e a modernização da medicina nacional. As raízes e partes inteiras de Desmodium caudatum (Thunb.) DC. tem sido amplamente utilizado para aliviar o desconforto estomacal na área de Beichuan Qiang da cidade de Mianyang por um longo período. Alguns artigos indicam a base científica para o tratamento de doenças gastrointestinais com D. caudatum, citando seus efeitos como hemostasia, antioxidante e proteção gastrointestinal 12,13,14. No entanto, devido à falta de pesquisas aprofundadas, nenhum mecanismo farmacodinâmico clínico foi estabelecido. Este artigo tem como objetivo estudar os efeitos de D. caudatum no tratamento de gastrites com base em hormônios gastrintestinais e flora intestinal, fornecendo uma base para sua aplicação clínica racional.
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Protocol
Os procedimentos para o cuidado e uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Normal de Mianyang, e todas as regulamentações institucionais e governamentais relevantes sobre o uso ético de animais foram rigorosamente seguidas. Para o presente estudo, ratos SPF (espécie Kunming, machos e fêmeas, pesando 180-220 g) foram utilizados. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Todos os animais foram alojados em ambiente livre de patógenos e proporcionaram acesso ad libitum à ração.
1. Preparação dos reagentes
- Preparar uma solução de salicilato de sódio a 5% pesando 2,5 g de salicilato de sódio em pó (ver Tabela de Materiais) com uma balança eletrónica. Dissolva o pó em uma pequena quantidade de água destilada e dilua-o até um volume total de 50 mL.
- Preparar a decocção de D. caudatum (12,8 g/kg). Pesar 128 g de D. caudatum (ver Tabela de Materiais), colocá-lo num balão de fundo redondo contendo 1000 ml de água destilada de laboratório e concentrar-o num volume final de 100 ml.
2. Agrupamento e administração
- Divida os ratos em diferentes grupos e administre por via intragástrica as soluções necessárias.
OBS: Para o presente estudo, 18 ratos (9 machos e 9 fêmeas) foram divididos em três grupos: grupo controle (Grupo C), grupo modelo (Grupo M) e grupo tratamento (Grupo T), com 6 ratos em cada grupo. O grupo controle recebeu solução salina e o grupo modelo recebeu solução de salicilato de sódio a 5% por 5 semanas na dose de 10 mL/kg/dia15. O grupo de tratamento foi pré-tratado com solução de salicilato de sódio a 5% por 5 semanas na dose de 10 mL/kg/dia, seguida da administração de decocção de D. caudatum na dose de 1 mL/100 g por 10 dias15,16. - Coletar fezes dos ratos em tubos de microcentrífuga secos e estéreis usando o método de transporte de cauda17 no último dia do experimento e congelá-las em um freezer de ultrabaixa temperatura de nitrogênio líquido.
- Após o término da amostragem, sacrificar os ratos por deslocamento cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Abra a cavidade abdominal com tesoura para expor a aorta abdominal.
- Insira a agulha (23-25 G) quase paralela na aorta abdominal, colete o soro e conserve-o em um freezer de ultrabaixa temperatura. Retire os estômagos da cavidade abdominal16 e mergulhe em uma solução de formalina a 10% para preservação.
NOTA: No Grupo M, o modelo de gastrite crônica é considerado bem-sucedido se a mucosa gástrica estiver dilatada e congesta com morfologia glandularregular15, observando-se pequena quantidade de infiltrado de células inflamatórias na lâmina própria.
- Insira a agulha (23-25 G) quase paralela na aorta abdominal, colete o soro e conserve-o em um freezer de ultrabaixa temperatura. Retire os estômagos da cavidade abdominal16 e mergulhe em uma solução de formalina a 10% para preservação.
3. Secção patológica da parede gástrica
- Colher as amostras da parede gástrica dos ratos de cada grupo para cortes patológicos. Posteriormente, realizar coloração rotineira pela hematoxilina-eosina para observar e analisar as alterações patológicas18.
4. Determinação dos hormônios gastrointestinais séricos
- Na amostra de soro, detectar o conteúdo de gastrina (GAS) e malondialdeído (MDA)19 usando ELISA seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Utilize um leitor de microplacas para a análise.
5. Extração de DNA total fecal e amplificação e purificação por PCR
- Realizar extração de DNA microbiano utilizando o kit de isolamento de DNA disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) e determinar a concentração e pureza usando espectrofotômetro UV-Vis16. Posteriormente, avaliar a integridade do DNA por meio de eletroforese em gel de agarose1% 18.
- Amplificar o gene 16S rRNA da bactéria com os primers 338F (5′-ACT CCT, ACG, GGA, GGC, AGC, AG-3′) e 806R (5′-GAC TAC, HVG, GGG, GTW, TCT, AT-3′) usando um sistema de PCR termociclador17. Os primers são obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Siga o programa de PCR: desnaturação (3 min, 95 °C), seguida por 27 ciclos (30 s, 95 °C; 30 s, 55 °C; 45 s, 72 °C) e uma extensão final (10 min, 72 °C). Conduzir reações de PCR com os seguintes componentes: 4 μL de tampão DNA polimerase 5×, 2 μL de dNTPs 2,5 mM, 0,8 μL de cada primer (5 μM), 0,4 μL de DNA polimerase e 10 ng de DNA molde (ver Tabela de Materiais). - Extrair, purificar e quantificar os produtos da PCR sequencialmente usando gel de agarose 2%, kit de extração de DNA em gel comercialmente disponível e fluorômetro, respectivamente17.
6. Sequenciamento
NOTA: As etapas 6 e 7 são executadas seguindo métodos publicados anteriormente20,21.
- Utilize a plataforma Illumina para sequenciamento.
NOTA: Uma extremidade do fragmento de DNA complementa a base do conector embutido no chip, prendendo-o no chip. A outra extremidade complementa aleatoriamente a base de outra junta adjacente enterrada, formando uma "ponte". - Realizar amplificação por PCR para gerar clusters de DNA. Linearize amplificadores de DNA em fitas simples.
- Introduzir uma DNA polimerase alterada ao lado de desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTPs) com quatro marcadores fluorescentes distintos. Sintetizar apenas uma base por ciclo.
- Utilizar um laser para escanear a superfície da placa de reação e determinar os tipos de nucleotídeos polimerizados durante a reação inicial de cada sequência de molde.
- Clivar quimicamente o "grupo de fluorescência" e o "grupo de terminação" para restabelecer a extremidade pegajosa de 3'. Posteriormente, avançar para a polimerização do segundo nucleotídeo.
- Obter a sequência de fragmentos de DNA molde analisando os resultados do sinal de fluorescência coletados em cada rodada.
7. Tratamento de dados de sequenciação
- Inicialmente, corte as leituras de dados brutos do fastq em qualquer local com uma pontuação < Q20 e elimine leituras com bases incertas. Além disso, permita duas incompatibilidades em primers precisamente combinados. Posteriormente, mesclar as sequências com uma sobreposição >10 pb.
- Agrupar unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com 97% de similaridade usando UPARSE, e remover sequências quiméricas com UCHIME20,21.
- Empregar o algoritmo Classificador RDP para analisar a taxonomia de cada sequência do gene 16S rRNA contra o banco de dados Silva (SSU123) 16S rRNA, usando um limiar de confiança de 70%.
- Realizar análise de diversidade Alpha e análise de diversidade Beta usando Mothur e Qiime, respectivamente (consulte Tabela de Materiais).
8. Análise estatística
- Analise os dados deste estudo usando um software de análise estatística (ver Tabela de Materiais). Empregar análise de variância (ANOVA) one-way para comparações entre múltiplos grupos e utilizar o teste de diferença mínima significativa (LSD) para comparações entre dois grupos.
- Considerar P < 0,05 como estatisticamente significante em todas as comparações. P < 0,01 é considerado extremamente significativo.
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Representative Results
Os resultados do corte anatomopatológico da parede do estômago estão representados na Figura 1. Em comparação ao Grupo C, o Grupo M apresentou atrofia discreta da parede gástrica e inflamação leve. No entanto, quando comparado ao Grupo M, o Grupo T não apresentou inflamação evidente, metaplasia intestinal ou atrofia. Isto sugere que a decocção de D. caudatum pode efetivamente melhorar a gastrite.
Os resultados da dosagem hormonal gastrintestinal sérica estão apresentados na Figura 2. O conteúdo de malondialdeído (MDA) foi significativamente maior no Grupo M do que no Grupo C. Após o tratamento com decocção de D. caudatum , houve redução significativa. Em relação ao conteúdo de gastrina (GAS), o Grupo M apresentou níveis significativamente menores que o Grupo C, mas o Grupo T apresentou aumento significativo. Estes resultados indicam que a decocção de D. caudatum pode regular o nível de hormônios gastrintestinais no tratamento da gastrite.
A análise da diversidade alfa, como mostrado na Tabela 1 e Figura 3, revela uma diferença significativa entre as comunidades do Grupo M e do Grupo T. O número de bactérias do Grupo C e do Grupo T é maior do que o do Grupo M, sugerindo que o número e os tipos de bactérias intestinais em ratos tendem gradualmente a um nível normal após o tratamento.
Análise da composição de espécies
De acordo com a Figura 4A, o barplot da comunidade ilustra que Lactobacillus e norank_f__Muribaculaceae respondem pela maior proporção no Grupo C. O Grupo M contém uma maior abundância de Clostridium_sensu_stricto_1 e alguns Helicobacter. A composição da comunidade do Grupo T é mais semelhante à do Grupo C, com componentes importantes sendo Lactobacillus e Romboutsia. Adicionalmente, o mapa de calor de correlação de Spearman (Figura 4B) combinado com o diagrama circos (Figura 4C) revela diferenças significativas na composição da flora entre o Grupo C e o Grupo M, com variações distintas na flora dominante. Após o tratamento, o Grupo T tende a retornar ao estado normal da flora. Além disso, a Figura 5 indica diferenças extremas na composição da comunidade entre o Grupo M e o Grupo C, com mudanças significativas ocorrendo na estrutura e composição da flora intestinal em ratos com gastrite. Após o tratamento, há semelhanças na composição da flora entre o Grupo C e o Grupo T, bem como algumas semelhanças entre o Grupo T e o Grupo M. Estes resultados indicam que a decocção de D. caudatum pode restaurar a flora intestinal de ratos com gastrite a um estado normal ou próximo do normal.
Análise de diferenças entre espécies
A partir do gráfico de colunas de comparação multiespécies da Figura 6A, pode-se observar que Norank_f_Muribaculaceae é abundante no Grupo C e difere significativamente do Grupo M e do Grupo T. Após o tratamento, o número de Norank_f_Muribaculaceae no Grupo T apresenta tendência crescente. Além disso, Clostridium_sensu_stricto_1, abundante no Grupo M, exibe resiliência em ambientes agressivos. Após o tratamento, o número diminui significativamente, sugerindo que a decocção de D. caudatum melhora o ambiente de sobrevivência da flora intestinal até certo ponto. Por outro lado, a análise da árvore de hierarquia de espécies multinível LEfSe na Figura 6B indica 44 espécies com diferenças significativas entre os grupos. Norank_f_muribaculaceae, Clostridium_sensu_stricto_1 e Romboutsia foram abundantes nos grupos C, M e T, respectivamente.
Figura 1: Resultados da secção patológica da parede do estômago. (A) Secção patológica do estômago no Grupo C. (B) Secção patológica do estômago no Grupo M. (C) Secção patológica do estômago no Grupo T. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Conteúdo dos hormônios gastrointestinais séricos. (A) Gráfico de análise de barras dos resultados da determinação do MDA (malondialdeído). (B) Gráfico de análise de barras dos resultados da determinação do GAS. *P < 0,05, **P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Grama da coluna do índice de diversidade T. A barra vermelha representa o Grupo C, o azul representa o Grupo T, enquanto o verde representa o Grupo M.*P < 0,05, **P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise da composição da comunidade. (A) Análise do histograma comunitário. B) Análise do mapa de calor comunitário ao nível do género. (C) Análise de diagrama circo da relação entre amostras e espécies. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise PLS-DA ao nível do género. O vermelho representa o Grupo C, o azul representa o Grupo T e o verde representa o Grupo M. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise da diferença de espécies. (A) Gráfico de barras de teste Kruskal-Wallis H. (B) Mapa arbóreo de espécies multiníveis de LefSe. O vermelho representa o Grupo C, o azul representa o Grupo T e o verde representa o Grupo M. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Grupo | Valor médio | Desvio padrão |
| C | 3.5201 | 0.63641 |
| M | 3.2755 | 0.28494 |
| T | 3.5388 | 0.29945 |
Tabela 1: Resultados do índice de diversidade alfa.
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Discussion
D. caudatum, uma medicina popular comumente utilizada pela nacionalidade Qiang12, tem demonstrado eficácia significativa no tratamento de doenças gastrointestinais. Com o avanço das pesquisas farmacológicas modernas, o desequilíbrio da flora resultante do desequilíbrio da microecologia gastrointestinal é identificado como um fator-chave nas doenças gastrointestinais agudas ecrônicas22,23. Certos micro-organismos no trato intestinal desempenham um papel crucial na manutenção do equilíbrio dinâmico no corpo, e os hormônios no soro refletem o estado fisiológico e patológico do corpo. Portanto, o estudo se concentra na flora intestinal e nos hormônios gastrointestinais.
O sequenciamento genético de alto rendimento do 16S rRNA é um método primário para detectar micro-organismos intestinais. Permite a detecção de tipos e funções de microrganismos nas amostras coletadas, permitindo análises precisas e quantitativas de cada espécie de microrganismo intestinal. Nos últimos anos, o sequenciamento genético de alto rendimento do 16S rRNA tem se desenvolvido rapidamente e sido amplamente utilizado para análise da diversidade microbiana em vários ambientes ecológicos 24,25,26.
Os efeitos de D. caudatum sobre a flora intestinal de ratos com gastrite foram investigados através de uma comparação detalhada das comunidades bacterianas intestinais em três grupos com base no sequenciamento do gene 16S rRNA baseado em Illumina. Pesquisas científicas modernas indicam que Lactobacillus, norank_f__Muribaculaceae, Romboutsia e Bifidobacterium são probióticos, cada um com benefícios específicos para a saúde, como redução do risco de múltiplos tumores malignos, produção de vitamina K com potencial anti-inflamatório, promoção do metabolismo de polissacarídeos e melhora da diarreia e constipação 27,28,29 . Clostridium_sensu_stricto_1, bactéria patogênica na lesão intestinal, pode causar inflamação e bacteremia e está intimamente ligada a tumores sanguíneos e gastrointestinais30. A gastrite crônica e a gastrite atrófica contribuem significativamente para os tumoresgástricos31.
A análise beta indica mudanças significativas no conteúdo de Lactobacillus, norank_f__Muribaculaceae, Romboutsia, Bifidobacterium, e Clostridium_sensu_stricto_1 após o tratamento. O conteúdo de Lactobacillus, norank_f__Muribaculaceae, e Romboutsia aumentou significativamente, enquanto Bifidobacterium e Clostridium_sensu_stricto_1 diminuíram significativamente após o tratamento com D. caudatum . Além disso, o barplot da comunidade sugere que a composição da comunidade do Grupo T é mais semelhante à do Grupo C. Estes resultados indicam que D. caudatum pode melhorar a prevalência de gastrite em ratos. No entanto, os mecanismos específicos por trás da redução no conteúdo do probiótico Bifidobacterium por D. caudatum requerem mais pesquisas.
O método ELISA kit possui alta sensibilidade, forte especificidade, simplicidade na operação e adequação para amostras pequenas32. Neste estudo, foi utilizado para detectar o conteúdo de malondialdeído (MDA) e gastrina (GAS) em soro de ratos. O MDA reflete o grau de peroxidação lipídica, indicando indiretamente a extensão do dano celular. Em ratos com gastrite, o nível de MDA foi significativamente maior do que em ratos normais, sugerindo danos às células parietais gástricas. O tratamento com D. caudatum diminuiu significativamente o nível de MDA, indicando seu potencial no tratamento da gastrite. Por outro lado, D. caudatum aumentou o nível reduzido de SGA, contribuindo para o reparo ou tratamento da gastrite.
No entanto, há limitações tanto para o sequenciamento genético de alto rendimento do 16S rRNA quanto para o método do kit ELISA. No sequenciamento genético de alto rendimento do 16S rRNA, a baixa resolução pode tornar difícil distinguir cepas ou gêneros com sequências altamente semelhantes, levando a dificuldades na classificação em níveis taxonômicos mais altos, como gênero, família ou filo33. Para o método do kit ELISA, etapas de pré-tratamento da amostra, como diluição e lavagem, geralmente são necessárias, introduzindo possíveis erros e variabilidade34.
Este estudo sugere que D. caudatum pode tratar gastrite regulando hormônios gastrointestinais e flora intestinal, fornecendo informações sobre suas amplas aplicações clínicas. No entanto, pesquisas futuras devem se aprofundar em outros hormônios gastrointestinais, os mecanismos de regulação da flora intestinal e os produtos químicos eficazes envolvidos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos principais projetos de P&&D do Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (2020YFS0539).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alpha diversity analysis | Mothur 1.30.2 | ||
| AxyPrep deoxyribonucleic acid (DNA) gel extraction kit | Axygen Biosciences | AP-GX-50 | |
| Beta diversity analysis | Qiime 1.9.1 | ||
| Cryogenic refrigerator | Forma-86C ULT freezer | ||
| Desmodium caudatum | The Traditional Chinese Medicine Hospital of Beichuan Qiang Autonomous County | ||
| E.Z.N.A. soil kit | Omega Bio-tek | D5625-01 | |
| Illumina MiSeq Platform | Illumina Miseq PE300/NovaSeq PE250 | ||
| Multiskan Spectrum | spectraMax i3 | ||
| OTU clustering | Uparse 7.0.1090 | ||
| OTU statistics | Usearch 7.0 | ||
| PCR instrument | TransGen AP221-02 | ||
| PCR instrument | ABI GeneAmp 9700 | ||
| QuantiFluor-ST double-stranded DNA (dsDNA) system | Promega Corp. | ||
| Sequence classification annotation | RDP Classifier 2.11 | ||
| Sodium salicylate | Sichuan Xilong Chemical Co., Ltd | 54-21-7 | |
| SPF rats | Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd | ||
| SPSS 18.0 | IBM |
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