Overview
Denna artikel beskriver DNA-extraktion från zebrafisk svansklämma. Protokollet visar en snabb och effektiv metod för att analysera zebrafisk genotyper.
Protocol
1. DNA-preparat
- Förbered DNA-lysbuffert: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Interpolering 20, 0,3% NP40. Tillsätt färskt Proteinase K till en slutlig koncentration på 1 mg/ml på användningsdagen.
- Vävnadsinsamling:
- För vuxen fiskfena klipp:
- Bedöva fisk: Placera fisken i 0,004% MS-222 (trikain) lösning. Vänta tills gillrörelsen saktar ner.
- Lägg fisk på en stapel med 5-10 Kimwipes och skär en liten bit av svansfenan, ca 2-3 mm, med ett sterilt rakblad.
- Placera snabbt fisken i en märkt tank med färskt vatten för återhämtning; märk noggrant både tanken och motsvarande rör som innehåller fenklämman. Byt vatten och mata fisken varannan dag.
- Plocka upp fenklämman med en steril pipettspets och överför den till ett rör fyllt med 100 μl DNA-lysbuffert.
- Kassera pipettspetsen och kasta rakbladet i en behållare med vassa föremål.
- För embryostjärtklämma:
- Placera embryon i 0,004% MS-222 (trikain) lösning. Vänta två minuter.
- Skär en bit svans med tång under ett dissekerande mikroskop.
- Lägg svansen i ett märkt rör fyllt med 30 μl DNA-lysbuffert.
- Lägg snabbt embryot i ett rör som innehåller 100 μl 4% paraformaldehyd.
- Märka rör med embryon och motsvarande svansrör.
- Förvara rören med embryon vid 4 °C över natten för fixering.
- Rengör tången med Milli-Q-vatten och Kimwipes mellan varje embryo för att minimera kontaminering.
- För hela embryon:
- Placera embryon i 0,004% MS-222 (trikain) lösning. Vänta två minuter.
- Lägg 1-5 embryon i ett rör fyllt med 100 μl DNA-lysbuffert. Dechorionation är inte nödvändigt.
- För vuxen fiskfena klipp:
- DNA-matsmältning
Inkubera rör med vävnad (fen- eller svansklämmor eller embryon) vid 55 °C i 4 timmar fram till över natten. - Inaktivera Proteinas K
Värmerör upp till 95 °C i 15 min. DNA ska omedelbart användas för PCR eller förvaras vid -20 °C i upp till 3 månader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
Tricaine | |||
Paraformaldehyde |