一个反向遗传学方法测试胚胎发育过程中的功能冗余
Summary
基因的功能，可以掩盖损失功能的实验中，如果有另一种基因的赔偿。斑马鱼模型提供了一个相对高通量的手段来揭示生活胚胎这样的功能冗余。
Abstract
通常由胚胎发育过程中基因功能丧失功能的实验，例如，通过有针对性的突变在小鼠（淘汰赛）。在斑马鱼模型，有效的反向遗传技术已经开发使用微量注射特定基因的反义morpholinos。 Morpholinos目标，通过特定的碱基配对和阻止基因的功能mRNA的瞬时抑制翻译或数天的胚胎发育过程中的拼接（击倒）。然而，在脊椎动物，如鼠标或斑马鱼，一些基因的功能可以被遮蔽的损失进行补偿的另一种基因的存在，由于这些方法。这是基因姐姐在同一发展组织共同表达的基因的家庭尤其如此。在斑马鱼，补偿功能，可以在一个相对高通量的方式进行测试，共注射morpholinos目标击倒的这两个基因同时。同样，使用morpholinos，任何两个基因之间的遗传相互作用，可以证明这两个基因敲除在亚阈值水平。例如，morpholinos可滴定等，无论是个人击倒生成一个表型。下，如果这些条件中，双方morpholinos的合作注入导致的表型，是一种遗传性的互动。在这里，我们演示了如何显示在两个相关的转录因子GATA转录因子方面的功能冗余。转录因子GATA因素是必不可少的心脏祖细胞的规范，但是这仅仅是损失Gata5和Gata6透露。我们如何进行显微注射实验，验证morpholinos，评估补偿cardiogenesis表型。
Protocol
Discussion
在这里描述的实验，我们结合两个morpholinos，每个单独产生不同表型的范围，并发现一个完全不同的表型时，他们一起合作注入。当然，我们需要摆在首位，做实验的理由。我们怀疑这两个基因可能为早期功能补偿对方在这种情况下心脏规范，。这是因为基因高度相关（相同的DNA序列结合的能力）和重叠在胚胎发育 5的模式表示。此外，在果蝇遗传实验表明，GATA转录因子应为心脏规…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
在编制本介绍我们感谢他们的帮助埃文斯实验室成员。原来，这里使用的morpholinos博士奥黛丽Holtzinger表示验证。 TE是由来自美国国立卫生研究院（HL064282 HL056182）的赠款支持。按照研究所动物护理和使用委员会规定的准则和法规威尔康乃尔医学院，进行动物实验。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
Riferimenti
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
