A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese
Summary
A função do gene pode ser obscurecida na perda de função experimentos se houver compensação por outro gene. O modelo de zebrafish fornece um relativamente alto rendimento significa revelar redundância funcional como em embriões vivos.
Abstract
A função do gene durante a embriogênese é normalmente definida por perda de função experimentos, por exemplo, mutagênese alvo (knockout) no mouse. No modelo peixe-zebra, eficazes técnicas de genética reversa têm sido desenvolvidos usando microinjeção de morpholinos gene antisense específicos. Morpholinos alvo um mRNA através da base de emparelhamento específica e função do gene bloco transitoriamente pela tradução inibir ou splicing por vários dias durante a embriogênese (knockdown). No entanto, em vertebrados, como mouse ou peixe-zebra, algumas funções do gene pode ser obscurecida por estas abordagens, devido à presença de outro gene que compensa a perda. Isto é especialmente verdade para as famílias de genes que contém genes irmã que são co-expressos nos mesmos tecidos em desenvolvimento. Em peixes-zebra, a remuneração funcional pode ser testada de uma forma relativamente alto rendimento, por co-injeção de morpholinos que knockdown alvo de ambos os genes simultaneamente. Da mesma forma, usando morpholinos, uma interação genética entre dois genes pode ser demonstrado pelo knockdown de ambos os genes juntos no sub-threshold níveis. Por exemplo, morpholinos pode ser ajustada de tal forma que nem knockdown indivíduo gera um fenótipo. Se, nessas condições, co-injeção de ambos morpholinos causa um fenótipo, uma interação genético é mostrada. Aqui demonstramos como mostrar redundância funcional no contexto de dois fatores de transcrição GATA relacionados. Fatores GATA são essenciais para a especificação de células progenitoras cardíacas, mas isso só é revelada pela perda de ambos os Gata5 e Gata6. Mostramos como a realização de experimentos microinjeção, validar o morpholinos, e avaliar o fenótipo compensado do coração.
Protocol
Discussion
No experimento descrito aqui, combinamos duas morpholinos, cada qual por si só gerar uma gama de fenótipos distintos, e encontrou um fenótipo totalmente diferente quando foram co-injetados juntos. É claro, precisávamos de uma justificação para fazer esta experiência, em primeiro lugar. Nós suspeitamos que os dois genes pode compensar o outro para uma função mais cedo, nesta especificação caso cardíaca. Isso ocorre porque os genes são altamente relacionados (e capazes de se ligar às seqüências de DNA me…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a membros do laboratório de Evans pela sua ajuda na preparação desta apresentação. O morpholinos usados aqui foram originalmente validados pelo Dr. Audrey Holtzinger. TE é suportado por concessões do National Institutes of Health (HL064282 e HL056182). Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Instituto de Animal Care e do Comitê de Uso, do Weill Cornell Medical College.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
Riferimenti
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
