Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Summary

Gene-Funktion kann in loss-of-function Experimente verdeckt werden, wenn es eine Kompensation durch ein anderes Gen. Der Zebrafisch-Modell bietet eine relativ hohem Durchsatz, um eine solche funktionelle Redundanz in lebenden Embryonen zu offenbaren.

Abstract

Gene-Funktion während der Embryogenese wird typischerweise durch loss-of-function Experimente definiert, zum Beispiel durch gezielte Mutagenese (KO) in der Maus. In der Zebrafisch-Modell, über wirksame reverse genetische Techniken entwickelt, mit Mikroinjektion von Gen-spezifischen Antisense Morpholinos. Morpholinos Ziel einer mRNA durch spezifische Basenpaarung und Block Genfunktion vorübergehend durch die Hemmung der Translation oder Spleißen für mehrere Tage während der Embryogenese (Zuschlag). Doch bei Wirbeltieren wie Maus oder Zebrafisch, können einige Funktionen von Genen durch diese Ansätze durch die Anwesenheit eines anderen Gens, das für den Verlust entschädigt verdeckt werden. Dies gilt insbesondere für die Gen-Familien, die Schwester Gene, die in der gleichen entwickelnde Gewebe co-exprimiert. In Zebrafisch können funktionelle Kompensation in einem relativ hohen Durchsatz Weise getestet werden, durch Co-Injektion von Morpholinos dieses Ziel Knockdown von beiden Genen gleichzeitig. Ebenso mit Morpholinos, kann eine genetische Interaktion zwischen zwei Genen, die durch Knockdown beider Gene demonstriert zusammen mit sub-Schwellenwerte. Zum Beispiel kann Morpholinos titriert, so dass weder einzelne Knockdown einen Phänotyp erzeugt werden. Wenn unter diesen Bedingungen, Ursachen Co-Injektion von sowohl Morpholinos einem Phänotyp, ist eine genetische Interaktion gezeigt. Hier zeigen wir, wie man funktionale Redundanz im Rahmen von zwei verwandten GATA-Transkriptionsfaktoren zeigen. GATA Faktoren sind für die Spezifikation von kardialen Vorläuferzellen notwendig, aber dies ist nur durch den Verlust der beiden Gata5 und Gata6 enthüllt. Wir zeigen, wie die Durchführung Mikroinjektion Experimente bestätigen die Morpholinos, und bewerten die ausgeglichen Phänotyp für Kardiogenese.

Protocol

Unser Ziel ist es, die funktionelle Redundanz von zwei Transkriptionsfaktoren für die Spezifikation von Kardiomyozyten Vorfahren zu testen. Die Faktoren werden von den beiden Genen gata5 und gata6 kodiert, und wir sind mit dem Zebrafisch-Modell, um ihre relative Funktionen 1 zu verstehen. Unsere Strategie ist es Genfunktion mit Morpholinos 2 Block. Wir werden Morpholinos für die eine oder andere Gen in befruchtete Eier zu injizieren, und vergleichen Sie die embryonalen Phänotyp…

Discussion

In dem hier beschriebenen Experiment, kombiniert man zwei Morpholinos, von denen jeder allein erzeugen eine deutliche Reihe von Phänotypen, und fand eine ganz andere Phänotyp, wenn sie co-injiziert zusammen. Natürlich benötigten wir eine Rechtfertigung dafür dieses Experiment in den ersten Platz. Wir vermuteten, dass die beiden Gene könnten sich gegenseitig für eine frühere Funktion zu kompensieren, in diesem Fall kardiale Spezifikation. Dies liegt daran, die Gene sehr verwandt sind (und in der Lage die Bindung …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Fish breeder tanks and dividers		Aquatic Habitats
Fish nets		Aquatic Habitats
System water				60mg “Instant Ocean” per liter dH2O
100mm Petri dishes		BD Falcon	351029
Micropipette needle puller		Sutter instruments, Co.	P-97 Flaming/Brown
3.5″ glass capillaries		Drummond	3-000-203-G/X
Razor blade		Personna	94-120-71
Micro grinder		Narishige, Japan	EG-4
Gridded microscope eyepiece		Premiere	MF-02
Micrometer		Ward’s Natural Science	94 W 9910
Ultrapure agarose		Invitrogen	15510-027
Spatula		Fisher	14-357Q
Scale		Mettler Toledo	AB54-S/FACT
Disposable weigh dishes		Fisher	2-202-B
Conventional microwave		General Electric
Erlenmeyer flask		Corning	4980
Microscope slides		Fisher	12-552
Graduated cylinder		Fisher	08-572-6D
Automatic pipette man		BrandTech	2026333
70% ethanol wash solution		Tarr	801VWR
N2 tank		Tech Air
Microinjector		Harvard apparatus	PLI-100
Micromanipulator		Micro Instruments	LTD
Dissecting microscope		Nikon	SMZ1500
Parafilm		American National Can	PM-992
Mineral oil		Sigma	M5904
Kimwipes		Kimberly-Clark	34155
gata5 splice site morpholino		Genetools, LLC		5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′
gata5 ATG Blocker		Genetools, LLC		5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′
gata6 Long Isoform ATG Blocker		Genetools, LLC		5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′
Disposable Pasteur Pipette		Fisher Scientific	13-678-20B
Tricaine Methanesulfonate		Argent Chemical Laboratories	MS-222
Methycellulose		ICN Biomedicals	155495
Heat Block		Fisher	11-718-4
Sharp forceps		Dumont		Size 55
Depression Microslides		VWR	48339-009