Dissociação Mecânica: Um Método para Obter Células Viáveis de um tecido

Abstract

Fonte: Garaud et. al., Um Protocolo Simples e Rápido para Tecidos Humanos Frescos Não Enzimaticamente Dissociados para a Análise de Linfócitos Infiltrados. J. Vis. Exp. (2014).

Este vídeo descreve a dissociação não enzimática do tecido humano fresco para obter células viáveis. A técnica é utilizada para análise qualitativa e quantitativa de células positivas CD45 (linfócitos/leucócitos) presentes em diversos tecidos humanos normais e malignos.

Protocol

1. Preparação do homogeneizar tecido Os tecidos dissecados (tecido maligno e normal ressecado da sala de cirurgia) estão no laboratório de patologia por pessoal treinado para coleta imediata. Tumor, NANT (retirados da maior distância possível do tumor) e fragmentos normais de tecido são rotineiramente processados dentro de 1 – 3 horas de excisão cirúrgica em um laboratório BSL2 usando procedimentos padrão de biossegurança para tecidos humanos. Um fluxograma do protocolo é ilustrado na Figur…

Representative Results

Figura 1: Fluxograma de protocolo. Nosso procedimento para o processamento de tecidos humanos frescos e algumas abordagens analíticas que podem ser posteriormente usadas para avaliar linfócitos infiltrados em tecidos humanos são mostrados. Figura 2: Imagem manchada de H&E de uma impressão de tecido …

Materials

GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain