Dissociazione Meccanica: Un metodo per ottenere cellule vitali da un tessuto

Abstract

Fonte: Garaud et al., Un protocollo semplice e rapido per dissociare non enzimaticamente i tessuti umani freschi per l’analisi dei linfociti infiltrati. J. Vis. Exp.

Questo video descrive la dissociazione non enzimatica del tessuto umano fresco per ottenere cellule vitali. La tecnica è utilizzata per l’analisi qualitativa e quantitativa di cellule positive CD45 (linfociti/leucociti) presenti in vari tessuti umani normali e maligni.

Protocol

1. Preparazione dell’omogeneato tissutale I tessuti sezionati (tessuto maligno e normale reinsediato dalla sala operatoria) si trovano nel laboratorio di patologia da personale addestrato per il ritiro immediato. Il tumore, il NANT (preso la distanza più lontana possibile dal tumore) e i frammenti di tessuto normale vengono regolarmente elaborati entro 1 – 3 ore dall’escissione chirurgica in un laboratorio BSL2 utilizzando procedure standard di biosicurezza per i tessuti umani. Un diagramma di flusso del proto…

Representative Results

Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo. Vengono mostrati la nostra procedura per la lavorazione di tessuti umani freschi e alcuni approcci analitici che possono successivamente essere utilizzati per valutare i linfociti che si infiltrano nei tessuti umani. Figura 2: Immagine macchiata H&E di un’im…

Materials

GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain