DNA-isotopo stabile sondaggio è un metodo di coltivazione-indipendente di identificare e caratterizzare le comunità di microrganismi attivi che sono in grado di utilizzare substrati specifici. L'assimilazione del substrato arricchito in isotopo pesante porta alla costituzione degli atomi indicati sull'etichetta in biomassa microbica. Ultracentrifugazione gradiente di densità recupera DNA etichettato per la valle analisi molecolari.
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Articolo metodologico
DNA Stabile-isotopica Probing (DNA-SIP)
In questo articolo
Sommario
Abstract
DNA-isotopo stabile sondaggio (DNA-SIP) è una tecnica potente per identificare i microrganismi attivi che assimilare particolari substrati di carbonio e di sostanze nutritive in biomassa cellulare. Come tale, questa coltura-indipendente tecnica è stata una metodologia per l'assegnazione di importanti funzioni metaboliche per le diverse comunità che abitano una vasta gamma di ambienti terrestri e acquatici. Dopo l'incubazione di un campione ambientale con isotopi stabili-molecole marcate, estratto acido nucleico è sottoposto a ultracentrifugazione gradiente di densità e di frazionamento gradiente successive per separare gli acidi nucleici di quote differenziate. Purificazione del DNA da cloruro di cesio recupera etichettati e privi di etichetta del DNA per la successiva caratterizzazione molecolare (ad esempio le impronte digitali, microarray, biblioteche clone, metagenomica). Questo protocollo video JOVE fornisce visive passo-passo le spiegazioni del protocollo per il frazionamento gradiente ultracentrifugazione gradiente di densità, e il recupero del DNA marcato. Il protocollo include anche i dati del campione SIP ed evidenzia importanti suggerimenti e precauzioni che devono essere considerati per assicurare il successo del DNA-SIP analisi.
Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
DNA-SIP richiede l'uso di reagenti che dovrebbe essere preparata in anticipo della procedura vera e propria. Le indicazioni per la preparazione di ogni reagente sono elencati in questa sezione e sono modificati da un precedente protocollo SIP 1.
- Cloruro di Cesio (CsCl), soluzione per la preparazione di gradienti SIP - Preparare una soluzione 7,163 M CsCl gradualmente sciogliendo 603,0 g di CsCl in acqua distillata e deionizzata (DDH 2 O) ad un volume finale di 500 mL. Fare attenzione a non superare i 500 ml! Il riscaldamento della soluzione leggermente mescolando aiuterà sciogl....
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Discussione
Corretta progettazione di stabili-isotopo esperimenti sondaggio è di importanza critica per l'ottenimento di DNA marcato al di sopra della comunità sfondo senza etichetta. Considerazioni relative a tempi di incubazione del campione, le concentrazioni di substrato, condizioni di incubazione (per esempio nutrienti, umidità del suolo), alimentazione incrociata e la replicazione sono stati discussi altrove 10,18 e si raccomanda al lettore di consultare le pubblicazioni quando si progetta un incubazione SIP. R.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto Strategico e borse di Discovery per JDN dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Bromofenolo blu | Reagente | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cloruro di cesio | Reagente | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Etilene alcol, grado reagente | Reagente | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Bromuro di etidio | Reagente | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Acido cloridrico | Reagente | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Poliacrilamide lineare | Reagente | Applichem | A6587 | |
| Polietilene glicole 6000 | Reagente | VWR international | CAPX1286L-4 | |
| Cloruro di potassio | Reagente | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Cloruro di sodio | Reagente | Fisher Scientific | S2711 | |
| Granuli di idrossido di sodio | Reagente | Fisher Scientific | S3181 | |
| Base Tris | Reagente | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Attrezzatura | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrifuga | Attrezzatura | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Attrezzatura | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Pompa per infusione | Attrezzatura | Braintree Scientific, Inc. | N/A | Numero modello: BSP Consultare www.braintreesci.com per i dettagli sull'ordine. |
| Sigillatore per tubi | Attrezzatura | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Ultracentrifuga | Attrezzatura | Beckman Coulter Inc. | ||
| Rotore per ultracentrifuga | Attrezzatura | Beckman Coulter Inc. | 362754 | |
| Sorgente di luce ultravioletta | Attrezzatura | UVP Inc. | 95-0017-09 | Qualsiasi sorgente UV è adeguata |
| Schermo facciale per luce ultravioletta | Attrezzatura | Fisher Scientific | 114051C | |
| Tappi in gomma butilica, grigi | Materiale | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Tubi per centrifuga | Materiale | Beckman Coulter Inc. | 342412 | |
| Ago ipodermico, calibro 23, lunghezza 2” | Materiale | BD Biosciences | 305145 | |
| Tubi microfuga, 1,5 mL | Materiale | DiaMed | AD151-N500 | |
| Guarnizioni centrali aperte, diametro 20 mm | Materiale | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pipette di Pasteur, in vetro | Materiale | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Punte per pipetta | Materiale | DiaMed | BPS340-1000 | Il numero di catalogo si riferisce a punte da 200 μl. Punte da 10 o 20 μl possono essere acquistate dalla stessa fonte |
| Tubazione per pompa, diametro interno 1,5 mm x spessore parete 1,5 mm | Materiale | Appleton Woods | ||
| Tubi con tappo a vite, 15 mL | Materiale | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Flaconi per siero, volume 125 mL | Materiale | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Siringa, 60 mL | Materiale | BD Biosciences | 309653 |
Riferimenti
- Neufeld, J. D. DNA stable-isotope probing. Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).
- Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a t....
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Ristampe e permessi
