L'ADN des isotopes stables de palpage (ADN-SIP)
Summary
L'ADN des isotopes stables de sondage est une méthode de culture-indépendante pour identifier et caractériser des communautés actives de microorganismes qui sont capables d'utiliser des substrats spécifiques. L'assimilation de substrat enrichi en isotope lourd conduit à l'incorporation des atomes marqués dans la biomasse microbienne. Ultracentrifugation en gradient de densité récupère l'ADN marqué en aval des analyses moléculaires.
Abstract
L'ADN des isotopes stables de sondage (DNA-SIP) est une technique puissante pour identifier les microorganismes actifs qui assimilent substrats carbonés particulier et des nutriments dans la biomasse cellulaire. Comme telle, cette technique de culture-indépendante a été une méthode importante pour assigner la fonction métabolique avec les diverses communautés vivant dans un large éventail de milieux terrestres et aquatiques. Suite à l'incubation d'un échantillon de l'environnement avec des isotopes stables des composés marqués, extraits d'acides nucléiques est soumis à une ultracentrifugation en gradient de densité et de fractionnement du gradient subséquente de séparer les acides nucléiques de densités différentes. Purification de l'ADN à partir de chlorure de césium récupère étiquetés et non étiquetés d'ADN pour la caractérisation moléculaire ultérieure (par exemple les empreintes digitales, les puces, les bibliothèques clone, métagénomique). Ce protocole fournit la vidéo JoVE visuelle étape par étape, des explications sur le protocole d'ultracentrifugation en gradient de densité de fractionnement du gradient, et la récupération d'ADN marqué. Le protocole comprend également des échantillons de données SIP et met en évidence d'importants conseils et avertissements qui doivent être considérées pour assurer un succès DNA-SIP analyse.
Protocol
Discussion
Une bonne conception des isotopes stables expériences de sondage est d'une importance critique pour l'obtention de l'ADN marqué au-dessus de la communauté de fond non étiquetés. Considérations relatives à l'échantillon des durées d'incubation, les concentrations de substrat, les conditions d'incubation (par exemple, les nutriments, l'humidité du sol), cross-alimentation et de reproduction ont été discutées ailleurs 10,18 et nous recommandons au lecteur de consulter ces…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le projet stratégique et subventions à la découverte de JDN en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
| Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR | CAPX1286L-4 | |
| Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
| Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
| Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
| Tube sealer | Equipment | Beckman-Coulter | 358312 | |
| Ultracentrifuge | Equipment | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman-Coulter | 362754 | |
| Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
| Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
| Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Centrifuge tubes | Material | Beckman-Coulter | 342412 | |
| Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD | 305145 | |
| Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
| Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
| Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
| Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Syringe, 60 mL | Material | BD | 309653 |
Riferimenti
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