ДНК-стабильный изотоп зондирования выращивание-независимый метод для определения и характеристики активных сообществ микроорганизмов, способных использовать специфические субстраты. Ассимиляция субстрата обогащенный тяжелым изотопом приводит к включению меченых атомов в микробной биомассы. Ультрацентрифугирования градиента плотности извлекает меченых ДНК для последующих молекулярного анализа.
ДНК-стабильный изотоп зондирования (ДНК-SIP) является мощным средством для идентификации активных микроорганизмов, усваивающих частности подложках углерода и питательных веществ в клеточную биомассу. Таким образом, это выращивание независимый метод был важным методологии присвоения метаболические функции различных общин, населяющих широкий диапазон наземных и водных средах. После инкубации экологические образца со стабильным изотопом меченых соединений, выделенных нуклеиновой кислоты подвергается плотность ультрацентрифугирования градиента и последующего фракционирования градиент на отдельные нуклеиновых кислот разной плотности. Очистка ДНК из хлорида цезия извлекает меченого и немеченого ДНК для последующего молекулярная характеристика (например, отпечатков пальцев, микрочипы, клон библиотеки, metagenomics). Это Юпитер протокола видео обеспечивает визуальную шаг за шагом объяснения протокол для градиента плотности ультрацентрифугирования, фракционирования градиента и восстановления меченых ДНК. Протокол также включает в себя образцы SIP данных и выделяет важные советы и предостережения, которые необходимо учитывать для обеспечения успешной ДНК-SIP анализа.
Правильное проектирование стабильных изотопов зондирования экспериментов имеет решающее значение для получения меченых ДНК выше фона немеченого сообщества. Соображения, связанные с образцом времени инкубации, субстрат концентрации, условия инкубации (например, питательных веществ…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана стратегических проектов и Discovery Гранты JDN от естествознания и техники Научно-исследовательский совет Канады (NSERC).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR | CAPX1286L-4 | |
Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
Tube sealer | Equipment | Beckman-Coulter | 358312 | |
Ultracentrifuge | Equipment | Beckman-Coulter | ||
Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman-Coulter | 362754 | |
Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
Centrifuge tubes | Material | Beckman-Coulter | 342412 | |
Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD | 305145 | |
Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
Syringe, 60 mL | Material | BD | 309653 |