रेटिना वर्णक उपकला फिजियोलॉजी और pathophysiology के अध्ययन प्रायोगिक मॉडल

Summary

हम मानव भ्रूण रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (hfRPE) कोशिकाओं के संवर्धन मिला हुआ monolayers के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीका है कि आकारिकी, शरीर विज्ञान, polarity, और वयस्क देशी ऊतक के प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शन प्रदान करते हैं. यह काम कई नेत्र रोगों का एक पशु मॉडल के लिए बढ़ा दिया गया है.

Abstract

हम एक सेल संस्कृति प्रक्रिया है कि प्राथमिक मानव भ्रूण देशी मानव RPE के morphological, शारीरिक और आनुवंशिक विशेषताओं के साथ रेटिना वर्णक उपकला (hfRPE) संस्कृतियों का मिला हुआ monolayers के बड़ी मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं विकसित किया है. ये hfRPE सेल संस्कृतियों भारी pigmentation के प्रदर्शन, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी व्यापक शिखर झिल्ली microvilli बताते हैं. junctional परिसरों immunofluorescence लेबलिंग के साथ विभिन्न तंग जंक्शन प्रोटीन की पहचान की गई. उपकला और ये आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्राथमिक संस्कृतियों के polarity समारोह बारीकी से पहले देशी RPE के मानव सहित स्तनधारी मॉडल, अध्ययन सदृश. इन परिणामों मानव नेत्र रोग के कई पशु मॉडल में उपचारात्मक उपायों के विकास द्वारा बढ़ाया गया. हम रेटिना या subretinal अंतरिक्ष में असामान्य तरल पदार्थ के संचय के हटाने के लिए रणनीतियों पर ध्यान केंद्रित किया है. कोशिकी subretinal अंतरिक्ष फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों और RPE के शिखर झिल्ली अलग और रेटिना संलग्नक के रखरखाव और RPE / रेटिना बातचीत की एक पूरी मेजबान के लिए महत्वपूर्ण है.

Protocol

1. मानव भ्रूण ऊतक सभी मानव ऊतकों से संबंधित अनुसंधान हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों और NIH संस्थागत समीक्षा बोर्ड के इस प्रकार है. भ्रूण आँखें एक स्वतंत्र कूतना, उन्नत Bioscience संसाधन (ABR, अल्मिडा, सीए) द्वारा प्राप्त कर रहे हैं, हमल के 16 से 22 सप्ताह में यादृच्छिक दाताओं, RPMI 1640 ट्यूबों (ABR द्वारा प्रदान की) से युक्त मीडिया में रखा, बर्फ पर भरे से, और एक रात प्राथमिकता डिलीवरी सेवा के द्वारा दिया. ऊतकों enucleation बाद व्यवहार्य 48 घंटे तक रहते हैं. 2. सेल संस्कृति के माध्यम सदस्य अल्फा संशोधित मध्यम (सिग्मा Aldrich) आधार माध्यम के रूप में प्रयोग किया जाता है करने के लिए तैयार 5% और 15% RPE कोशिकाओं के संवर्धन (RPE मध्यम, 1 नीचे टेबल) के लिए सीरम युक्त मीडिया. नाम सिग्मा Gibco मात्रा भंडारण सदस्य, अल्फा संशोधन M-4526 500 एमएल 4 ° C N1 पूरक N-6530 5 एमएल 4 ° C पेनिसिलिन – स्ट्रेप्टोमाइसिन 15140-148 5 एमएल -20 डिग्री सेल्सियस GlutaMax – मैं 35050 5 एमएल -20 डिग्री सेल्सियस गैर आवश्यक अमीनो एसिड M-7145 5 एमएल 4 ° C THT * -80 ° C Taurine T-0625 125 मिलीग्राम Hydrocortisone 10 एच – 0396 10 μg Triiodo – thyronin T-5516 ०.००६५ μg भ्रूण गोजातीय सीरम ** 5% या 15% -80 ° C तालिका 1. 500 एमएल मध्यम की तैयारी के लिए मानव भ्रूण RPE मध्यम अवयव * THT मध्यम करने से पहले एक 1.5 एमएल पीबीएस में taurine hydrocortisone-triiodo thyronin भंग द्वारा बनाई गई है. एकाधिक aliquots -80 में संग्रहीत हैं ° सी मध्यम संस्कृति के संवर्धन की तैयारी को सरल करने के लिए. ** भ्रूण गोजातीय सीरम सिग्मा Aldrich या Gibco से प्राप्त नहीं है. भ्रूण गोजातीय मीडिया की तैयारी में इस्तेमाल किया सीरम अटलांटा बायोलॉजिकल (Norcross, GA) से प्राप्त की है. सीरम के प्रत्येक बोतल (56 डिग्री सेल्सियस 1hr के लिए) निष्क्रिय उपयोग करने के लिए पूर्व गर्मी है. एक ही बहुत से सीरम के सेल संस्कृति स्थिरता बड़ी मात्रा सुनिश्चित खरीदा है और -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत कर रहे हैं जब तक वे मीडिया की तैयारी के लिए उपयोग किया जाता है. या 12 – अलग बहुत से 20% FBS युक्त मीडिया में एक कुछ हफ्तों के लिए अच्छी तरह प्लेटें hfRPE कोशिकाओं का एक विशिष्ट बैच से कम वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के 24 में बड़े हो रहे हैं. सबसे शास्त्रीय RPE आकारिकी (cobblestone) के साथ तेजी से बढ़ रही melanated कोशिकाओं एक उपयुक्त सीरम बहुत है कि सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है संकेत मिलता है. N1 पूरक (सिग्मा Aldrich) 1:100 एमएल / एमएल / GlutaMax पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन 1:100 एमएल / एमएल (Gibco), और nonessential एमिनो एसिड समाधान (सिग्मा Aldrich) 1:100 एमएल /: सेल संस्कृति माध्यम भी शामिल हैं एमएल. इसके अलावा, hydrocortisone (20 μg / एल), (250 मिलीग्राम / एल), taurine, और triiodo thyronin (0.013 μg / एल) (THT) पीबीएस में इन तीन घटकों 1:500 के एक अंतिम एकाग्रता भंग करके आगे तैयार है (एमएल / एमएल). THT के Aliquots 80 पर संग्रहित कर रहे हैं ° सी तक RPE माध्यम से जोड़ा. 3. सेल संस्कृति मिलने पर बरकरार ग्लोब एंटीबायोटिक antimycotic समाधान में rinsed हैं (10X को पतला;. बिल्ली नहीं 15240-096, Invitrogen) प्लस gentamicin (1 मिलीग्राम / एमएल) 3 से 5 मिनट के लिए (नीचे चित्र 1). चित्रा 1. ऊष्मायन के बाद एंटीबायोटिक दवाओं से rinsed HBSS या पीबीएस के रूप में इस तरह के माध्यम से दो बार. एक समय में एक आंख दुनिया Sylgard-184 (डब्ल्यूपीआई) के साथ लेपित के साथ 10 सेमी पेट्री डिश के लिए स्थानांतरित किया है और 27G सुइयों के साथ सुरक्षित. स्पष्ट sideport चाकू (Alcon) का उपयोग एक चीरा सिलिअरी शरीर (/ 1 पूर्वकाल सतह नेत्र भूमध्य रेखा से दूरी की 3) नीचे श्वेतपटल के माध्यम से किया जाता है. यह चीरा पूर्वकाल आंख भाग के हटाने के लिए एक परिपत्र कटौती शुरू करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस कटौती के साथ एक ब्लेड दाँतेदार (FST) टंगस्टन कार्बाइड लेपित घुमावदार परितारिका कैंची का उपयोग किया जाता है. आंख की पूर्वकाल हिस्सा के हटाने से पहले, एक कट कांच शरीर के माध्यम से किया जाता है आर detaching से बचनेपीछे ध्रुव पर RPE से etina. 40-60 मिनट के लिए 5% में सीरम युक्त मध्यम, आंख की पूर्वकाल भाग के बाद हटा दिया जाता है, पीछे पोल dispase – मैं समाधान (. Roche Diagnostics, इंडियानापोलिस, में 2 U / एमएल, बिल्ली नहीं 04942086001) के साथ incubated है 37 में ° सी 5% सीओ 2. Dispase उपचार के बाद, पीछे डंडे सिलिकॉन पैडिंग (184 Sylgard, डॉव Corning, मिडलैंड, एमआई) के साथ पेट्री डिश में एक HBSS स्थानांतरित कर रहे हैं और quadrants या बड़े टुकड़े करने के लिए पर्याप्त ऊतकों समतल में dissected. फिर धीरे रेटिना संदंश से हटाया है. एकल सेल RPE परतों बंद शीट में खुली थे और ठंड समाधान trypsin EDTA (Gibco, 25200-056 #) में सीधे एकत्र. बाद RPE एकत्र कर रहे हैं, trypsin – EDTA में ऊतकों के साथ ट्यूब सील कर रहे हैं और 10-15 मिनट के लिए पानी के स्नान में स्थानांतरित 37 में डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के 10 मिनट के बाद, ट्यूब सख्ती के छोटे समूहों में RPE अलग हिल रहे हैं. यदि जुदाई पूरा नहीं हुआ है, ट्यूब वापस पानी के स्नान में एक और 5 मिनट के लिए रखा जाता है. Trypsin – EDTA ऊष्मायन के बाद, ट्यूब संभव संयुक्त राष्ट्र भंग मिश्रित सेल समूहों के लिए निरीक्षण कर रहे हैं. कोई मनाया समूहों ठीक इत्तला दे दी कांच पाश्चर पिपेट का उपयोग कर हटा रहे हैं. नीचे कताई (4 मिनट के लिए 1.4 नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र पर rpm) के बाद, hfRPE कोशिकाओं रहे हैं 15% RPE मीडिया में फिर से निलंबित कर दिया और फिर Primaria बोतल में डाल (उदाहरण: बिल्ली 08-772-45 नहीं; फिशर साइंटिफिक, पिट्सबर्ग, फिलीस्तीनी अथॉरिटी. ). यह मध्यम 5% RPE सीरम युक्त मध्यम के साथ एक दिन के बाद बदला है, और बाद में परिवर्तन हर 2 से 3 दिनों में किए गए थे. 3 से 4 सप्ताह के बाद, कोशिकाओं को मिला हुआ है और समान रूप से pigmented बन गया. वे तो 0.25% 10 से 15 मिनट के लिए trypsin – EDTA में trypsinized कर रहे हैं, 15% सीरम युक्त RPE सेल संस्कृति माध्यम में फिर से निलंबित कर दिया है, और अच्छी तरह से 150 प्रति के लिए 200K कोशिकाओं (Transwell पर स्पष्ट सेल संस्कृति आवेषण पर वरीयता प्राप्त, Corning costar, Corning, NY), 12 मिमी व्यास आवेषण, 0.4 उम pores, पॉलिएस्टर झिल्ली (उदाहरण का उपयोग: बिल्ली नहीं 07-200-161, फिशर साइंटिफिक). बोने से पहले, कुओं मानव बाह्य मैट्रिक्स (150 μL HBSS में 10 प्रतिशत μg, बिल्ली नहीं 354237, बी.डी. बायोसाइंसेज, फ्रेंकलिन Lakes, NJ) के साथ लेपित रहे थे और हुड में 2 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के साथ ठीक है. कुछ मामलों में, trypsinization प्रक्रिया के लिए दूसरी बार दोहराया गया था, कोशिकाओं है कि पहली trypsinization के बाद अलग नहीं किया था इकट्ठा. एक ही प्रोटोकॉल (ईसीएम के साथ कोटिंग को छोड़कर) बोतल पर संस्कृति कोशिकाओं को इस्तेमाल किया गया था कोशिकाओं के P1 जनसंख्या उत्पन्न. इन कोशिकाओं को प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया जब वे ≥ 200 Ω • 2 सेमी की कुल ऊतक प्रतिरोध था और समान pigmented थे. एक बड़ी संख्या 1 के लिए यहाँ क्लिक करें . 4. कदम प्रक्रिया द्वारा कदम कई समाधान (4 कुओं की जरूरत प्रत्येक आँख के लिए) के साथ 12 अच्छी तरह से थाली तैयार: अच्छी तरह से 1 / आंख – 10x एंटीबायोटिक antimycotic समाधान जोड़ने पीबीएस / HBSS समाधान के लिए कुल्ला जोड़ – 2 कुओं / आँख dispase समाधान जोड़ – अच्छी तरह से 1 / आँख 5 निर्धारण सुइयों unpacking और यह HBSS के साथ भरने के द्वारा पेट्री डिश विदारक तैयार अनपैक आँखें और एंटीबायोटिक antimycotic समाधान में उन्हें 3-5 मिनट (चरण 1 में तैयार) के लिए जगह पीबीएस / HBSS के साथ दो कुओं (चरण 1 में तैयार) आँखों कुल्ला, तो उन्हें पकवान विदारक हस्तांतरण. छाँटो अत्यधिक मांसपेशियों और आंख के आसपास संयोजी ऊतक पकवान विदारक उन्हें एक तरीका है जहां कॉर्निया ऊपर चेहरे में aligning में 27G सुरक्षित सुइयों (सिलिकॉन का आधार है नीचे पिन) आँखों का उपयोग करना. Sideport चाकू का प्रयोग कॉर्निया नीचे चीरा बनाने के लिए, जहां परिपत्र कटौती शुरू हो जाएगा आंख के आसपास का उपयोग परितारिका कैंची काट कर, तब एक ही शीशे के माध्यम से काट और आंख की पूर्वकाल भाग दूर लिफ्ट कैंची का उपयोग कर. नोट: चरणों में 3 से 8 किसी भी अत्यधिक नेत्रगोलक यांत्रिक दबाव से बचने के. Dispase समाधान में खुली आँख स्थानांतरण (चरण 1 में तैयार) 40-60 मिनट के लिए 37 पर नजर कप सेते डिग्री सेल्सियस के साथ 5% सीओ 2 एक ताजा के साथ पकवान विदारक में HBSS समाधान बदलें. Dispase समाधान से विदारक पकवान आँख स्थानांतरण. पेट्री डिश में स्थिति आंख (नेत्रगोलक कप सामना करना पड़ रहा है) और दो 27G सुइयों के साथ सुरक्षित. धीरे लिफ्ट आंशिक रूप से अलग रेटिना और रेटिना रेटिना कैंची का उपयोग ऑप्टिक तंत्रिका से दूर कटौती. रेटिना त्यागें. आईरिस कैंची का उपयोग ऑप्टिक तंत्रिका की ओर आँख की परिधि से एक चीरा बनाते हैं. सभी पाँच 27G सुइयों का प्रयोग आँख बनाने RPE अच्छी तरह से बढ़ाकर परत समतल. रेटिनल कैंची का उपयोग ऑप्टिक तंत्रिका आसपास परिपत्र कटौती ऑप्टिक तंत्रिका लगाव से RPE परत को अलग करते हैं. नोट: 13-17 कदम कम बढ़ाई या स्टीरियो माइक्रोस्कोप के बिना किया जा सकता है है 250x बढ़ाई stereomicroscope समायोजितया अधिक और RPE परितारिका कैंची द्वारा बनाई गई कटौती के साथ ऑप्टिक तंत्रिका के करीब चादर के किनारे मिल. दो choroidal ऊतक परत से अलग RPE-Bruch झिल्ली संदंश का प्रयोग. यह कुछ प्रयास की आवश्यकता के किनारे जहां RPE और रंजित के संबंध कमजोर है साथ क्षेत्र को मिल सकता है. ठंड समाधान trypsin – EDTA प्लेस में 15 एमएल ट्यूब में RPE चादरें के बाद RPE 37 में 10-15mins के लिए trypsin EDTA में पानी के स्नान में ऊतकों के साथ एकत्र कर रहे हैं, टोपी और हस्तांतरण ट्यूब डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के 10 मिनट के बाद, सख्ती 15 एमएल ट्यूबों को मिलाने के लिए छोटे समूहों में RPE अलग. यदि जुदाई पूरा नहीं हुआ है, ट्यूब वापस एक और 5 मिनट के लिए पानी के स्नान में जगह. संभव संयुक्त राष्ट्र भंग मिश्रित सेल समूहों के लिए ट्यूब का निरीक्षण किया. कोई मनाया समूहों ठीक इत्तला दे दी कांच पाश्चर पिपेट का उपयोग कर हटाया जाना चाहिए. नीचे स्पिन (4 मिनट के लिए 1.4 नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र पर rpm) hfRPE कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला हटाने और 15% RPE मीडिया (9 एमएल कुल) में फिर से निलंबित कोशिकाओं Primaria बोतल ताजा 15% RPE मीडिया की 2 एमएल, इनक्यूबेटर में अगले दिन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) जब तक जगह फ्लास्क जोड़ने में सेल निलंबन के 3 एमएल रखो 5. प्रतिनिधि परिणाम HfRPE सेल संस्कृति के कार्यात्मक सत्यापन पिछले प्रयोगों में हम इन प्राथमिक संस्कृतियों का इस्तेमाल किया है करने के लिए अभिव्यक्ति और प्लाज्मा झिल्ली परिवहन प्रोटीन का ध्रुवीकरण समारोह का निर्धारण और विशिष्ट संकेतन मार्ग है कि RPE समारोह 1-11 इन विशेषताओं को विनियमित की पहचान के रूप में वे जमा कर रहे हैं एक गुण है कि लागू किया जा सकता है का सेट मान्यता प्रदान प्रत्येक कक्ष पीढ़ी के लिए. प्रयोगों को नीचे संक्षेप में प्रोटीन है कि transepithelial तरल पदार्थ परिवहन और paracellular मार्ग की अखंडता को निर्धारित की पहचान. इन विट्रो प्रयोगों में इन रेटिना पुनः reattachment 6 के एक पशु मॉडल में पुष्टि की है . चित्रा 2. CFTR hfRPE कोशिकाओं में स्थानीयकरण वाम ऊपरी पैनल: CFTR hfRPE झिल्ली समृद्ध अर्क का उपयोग कोशिकाओं में पाया गया था. एम, आणविक वजन मार्कर, 1 लेन, प्रमुख (बैंड सी) परिपक्व और अपरिपक्व केंद्र कम पैनल (ए और बी बैंड): CFTR के immunofluorescence स्थानीयकरण (हरी लेबल) शीर्ष सही पैनल: z दिखा विमान के माध्यम से बढ़े हुए पार अनुभाग को देखने . z-अक्ष के माध्यम से अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण. ZO 1 (लाल के रूप में चिह्नित) एक तंग जंक्शन RPE के शिखर और basolateral पक्षों delineating मार्कर के रूप में कार्य करता है. DAPI (नीला) लेबल नाभिक बेसल झिल्ली के पास स्थित है. ZO-1 के रूप में पीला / नारंगी, के बाद से उसके लाल लेबल overlaps CFTR से हरी प्रतिदीप्ति, प्रकट होता है. चित्रा 3. IFNγ प्रेरित hfRPE में शारीरिक परिवर्तन: एक बेसल स्नान के लिए IFNγ के अलावा प्राथमिक, सुसंस्कृत hfRPE कोशिकाओं के monolayer भर transepithelial तरल पदार्थ परिवहन (जम्मू v) की वृद्धि हुई जम्मू v शीर्ष ट्रेस में समय की एक समारोह है और शुद्ध द्रव के रूप में प्लॉट किए जाते है. अवशोषण (बेसल स्नान के शिखर) सकारात्मक मूल्यों ने संकेत दिया है, transepithelial (TEP) क्षमता और कुल ऊतक प्रतिरोध (आर एंड टी) नीचे निशान में समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते हैं. बी: CFTRinh – 172 (5 सुक्ष्ममापी) के बेसल स्नान के लिए जोड़ IFNγ उत्तेजित जम्मू ध् वृद्धि हिचकते हैं. नीचे पशु मॉडल प्रयोगों इन विट्रो निष्कर्षों में hfRPE की पुष्टि का एक उदाहरण है. इस प्रयोग में, कृत्रिम रूप से बनाया रेटिना टुकड़ी बाहरी आंख की सतह के लिए IFNg (चित्रा 4 ए, बी) के अलावा के बाद काफी कम हो गया था. यह प्रभाव आंशिक रूप से द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है: (1) शिविर अवरोधक (चित्रा 4D) के अलावा, (2) जे ए + शिविर ब्लॉकर्स के अलावा के बाद पूरी तरह से अवरुद्ध है. नीचे छवियाँ अक्टूबर स्कैनर का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. चित्रा 4 vivo रेटिना टुकड़ी प्रयोगों में vivo प्रयोगों में इन के लिए प्रक्रियाओं. पहले किया गया है 6 में विस्तार से वर्णित है. . इन प्रयोगों में, रेटिना टुकड़ी चूहा आंख में संशोधित पीबीएस समाधान के 0.5-3 μL के इंजेक्शन द्वारा subretinal अंतरिक्ष (एसआरएस), अकेले में या जे ए – स्टेट और PKA मार्ग inhibitors का एक संयोजन के साथ बनाया गया था. प्रत्येक प्रयोग रेटिना टुकड़ी के निर्माण के बाद 40-70 मिनट की एक प्रारंभिक अवधि नियंत्रण था. इस समय के दौरान, छाला मात्रा के परिवर्तन की दर छाला स्थिरता बीमा मापा गया था. ऑप्टिकल जुटना tomography इमेजिंग (एप्लाइड फिजिक्स संस्थान, विज्ञान के रूसी अकादमी, निज़नी नावोगरट, रूस) एसआरएस मात्रा में परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. फिर से लगाव खंड के समय पाठ्यक्रमume परिवर्तन ऑप्टिकल जुटना tomography (अक्टूबर) द्वारा मापा गया था. अक्टूबर कि टुकड़ी आकारों में एक परिवर्तन दिखा (ए, बी में तीर, और डी) 40-70 मिनट के लिए पूर्वकाल सतह के IFNγ अलावा निम्नलिखित, 4 अलग (ई. बाईं तरफ पैनल) प्रयोगों से छवियाँ. पैनलों ए और बी शो है कि IFNγ अपने नियंत्रण दर से वृद्धि हुई जेवी (2 ≈ μl • सेमी 2 • घंटा -1) से 14 और 12 μl • 2 सेमी • घंटा-1, क्रमशः . जे ए – स्टेट मार्ग और PKA inhibitors (सी और डी), IFNγ के अलावा के बाद प्रेरित अवशोषण की दर 0.2 और 7.9 के लिए काफी कम हो गई थी μl • 2 • घंटा-1 सेमी, क्रमशः . तीर धराशायी लाइन के भीतर संलग्न क्षेत्र (प्रारंभिक मात्रा) के साथ तुलना के लिए छाला की सीमा से संकेत मिलता है. आंकड़े के सही पक्ष: शीर्ष मापा जेवी दरों के कई प्रयोगों से पैनल – सारांश, मध्यम पैनल फिल्म ( यहाँ क्लिक करें ), कम पैनल 3 डी नीले रंग में बी Pseudocolor में संक्षेप प्रयोग के वर्गों t = 0 पर टुकड़ी के स्थानिक हद तक और इंगित करता है INFγ के अलावा के बाद 40 मिनट. सभी पशु प्रयोगों अनुपालन में विजन और नेत्र विज्ञान बयान में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के साथ आयोजित किया गया. प्रोटोकॉल पशु की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान का प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.

Discussion

वर्तमान प्रयोगों में, हम हमारे पहले प्रकाशित ³ एकाधिक आंख प्रति उपलब्ध कोशिकाओं के एक उच्च संख्या के साथ संगत hfRPE प्राथमिक संस्कृतियों के उत्पादन के लिए आवश्यक कदम को कारगर बनाने के के लिए डिज़ाइन तकनीक के अतिरिक्त संशोधनों का वर्णन. मूल प्रक्रिया में प्रत्येक परिवर्तन को कड़ाई से एकाधिक शरीर विज्ञान और आणविक जीव विज्ञान के प्रयोगों में परीक्षण किया गया था करने के लिए सुनिश्चित करें कि परिवर्तन कलाकृतियों परिचय नहीं था और जा रहा है लगातार कई अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा इन कोशिकाओं का उपयोग कर परीक्षण किया. अंत में, अतिरिक्त प्रयोगों से बाहर किए गए पशु मॉडल में इसी तरह के perturbations के इन विट्रो परिणामों में तुलना.

Materials

Instruments needed for dissection protocol

1. Stereo Microscope – any available with working magnification x250 needed for dissection
2. Dissecting dish – e.g. Kimble 100 x 20mm #23062 (one per dissection) any source
3. Sylgard 184 – WPI Cat. #SYLG184*
   * To prepare dissecting dish follow Sylgard 184 included mixing instructions, pour mixed liquid elastomer into Petri dish to form 5-8mm layer. Allow elastomer to cure for at least 24hrs. Dish with cured elastomer can be sterilized using 70% ethanol and reused multiple times (~100 times)
4. 27 G needles from B-D PrecissionGlide 1¼ length (5 per dissection) any source
5. HBSS 1X Solution containing Ca and Mg salts – GIBCO Cat.#14025 500ml (good for multiple dissections)
6. Iris scissors carbide serrated blade, curved – FST Cat.# 14559-11 (one)
7. Retinal scissors – Katena Cat.#K4-5300 (one)
8. Forceps – e.g. Dumont Tweezers #5 with polished tips from WPI Cat.#500085 (2 pieces)
9. Sideport knife – Alcon, ClearCut 1mm, Dual Bevel, angled Cat.#8065921540
10. Centrifuge tube 15ml – (one per eye) any source
11. Pasteur glass pipette – (one per dissection) any source
12. Plate 12 well (one per dissection) any source
13. Primaria 25cm² flask – (2-3 per eye) any source