Gründung Primary Adult Fibroblastenkulturen von Nagetieren

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Instandhaltung von Fibroblastenkulturen von Haut-und Lungengewebe von wilden Nagetieren.

Abstract

Die Bedeutung der Verwendung von primären Zellen, anstatt Krebszelllinien, für biologische Studien wird immer weithin anerkannt. Primäre Zellen sind in Studien der Kontrolle des Zellzyklus, Apoptose bevorzugt, und die DNA-Reparatur, wie Krebszellen Mutationen in Genen, die an diesen Prozessen beteiligt sind. Primäre Zellen kann nicht unbegrenzt durch das Einsetzen der replikativen Seneszenz oder aneuploidization kultiviert werden. Daher müssen neue Kulturen regelmäßig ermittelt werden. Das Verfahren zur Isolierung von Nagetier embryonalen Fibroblasten ist gut etabliert, aber isoliert Erwachsenen Fibroblastenkulturen oft eine Herausforderung. Adult Nagetier Fibroblasten aus Mausmodellen menschlicher Erkrankungen isoliert kann eine bevorzugte gesteuert werden, wenn man sie zu Fibroblasten aus menschlichen Patienten. Darüber hinaus sind erwachsene Fibroblasten die einzige verfügbare Material bei der Arbeit mit wilden Nagetieren, wo schwangere Frauen nicht leicht erhalten werden kann. Hier bieten wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von adulten Fibroblasten von Nagern Haut und Lunge. Wir haben dieses Verfahren erfolgreich an Fibroblasten aus über zwanzig Nagetieren isoliert vom Labor Mäusen und Ratten zu wilden Nagetieren wie Biber, Stachelschwein und Eichhörnchen.

Protocol

1. Vor dem Start Sterilisieren Schere und Pinzette mit 70% Ethanol. Legen Sie kleine Magnetrührer in einem 30 mL Becherglas mit zwei Lagen Folie, und Autoklaven zu decken. Bereiten Sie eine 28 Wunsch-Einheiten / ml Stammlösung von Liberase Blendzyme 3 in sterilem Wasser. Machen Sie 0,5 ml und bei -20 ° C. Tauwetter ein neues Aliquot vor jedem Einsatz. Die Lösung kann trübe aussehen nach dem Auftauen. Vortex die Lösung, bis es klar wird. Warm up den Zellkulturmedien. </…

Discussion

Normale primären Fibroblasten bieten eine hervorragende Alternative zu den etablierten Zelllinien in der biologischen Forschung. Ein wichtiger Vorteil von Fibroblasten ist, dass sie nicht tragen Mutationen in Onkogenen und Tumor-Unterdrücker und pflegen intakten Zellzyklus-Kontrollpunkte. Dies macht normalen Fibroblasten eine bevorzugte System für das Studium der Regulation des Zellzyklus, DNA-Reparatur und Apoptose. Die hier beschriebene Protokoll bietet ein einfaches Rezept für die Isolierung und Wartung von prim?…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM/F12 media		Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified		Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic		Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin		Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade		Roche	05401127001	Replacement enzyme.
				A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 – 10 mg, Cat. no. 05401127001 – 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media		ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel		Multiple suppliers
Three Gas Control incubator		Forma or Heraeus