Stabilire colture primarie di fibroblasti adulti dai roditori

Summary

Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento e il mantenimento delle colture primarie di fibroblasti della pelle e tessuto polmonare dei roditori selvatici.

Abstract

L'importanza di utilizzare cellule primarie, piuttosto che linee cellulari tumorali, per ricerche biologiche sta diventando ampiamente riconosciuto. Cellule primarie sono preferite in studi di controllo del ciclo cellulare, apoptosi, e la riparazione del DNA, le cellule tumorali sono portatori di mutazioni in geni coinvolti in questi processi. Cellule primarie non può essere coltivato a tempo indeterminato a causa della comparsa di senescenza replicativa o aneuploidization. Quindi, nuove culture devono essere stabiliti regolarmente. La procedura per l'isolamento di fibroblasti embrionali dei roditori è ben consolidata, ma isolando colture di fibroblasti adulti spesso è una sfida. Fibroblasti roditori adulti isolati da modelli murini di patologie umane può essere un controllo preferito quando li confronto a fibroblasti da pazienti umani. Inoltre, i fibroblasti adulti sono l'unico materiale a disposizione quando si lavora con i roditori selvatici in cui donne in gravidanza non possono essere facilmente ottenuto. Qui forniamo un protocollo per l'isolamento e la cultura dei fibroblasti adulti dalla pelle dei roditori e dei polmoni. Abbiamo usato questa procedura con successo per isolare fibroblasti da oltre venti specie di roditori da laboratorio, topi e ratti di roditori selvatici come il castoro, l'istrice e lo scoiattolo.

Protocol

1. Prima di partire Sterilizzare forbici e pinze con il 70% di etanolo. Piccolo agitatore magnetico all'interno di un bicchiere da 30 ml, coprire con due strati di stagnola, e autoclave. Preparare un 28 unità Wunsch / mL di soluzione stock Liberase Blendzyme 3 in acqua sterile. Fai aliquote 0,5 ml e congelare a -20 ° C. Scongelare un'aliquota di nuovo prima di ogni utilizzo. La soluzione potrebbe apparire torbida dopo lo scongelamento. Vortex la soluzione fino a quando diventa ch…

Discussion

Normali fibroblasti primari fornire un'ottima alternativa alle linee di cellule tumorali stabilito nella ricerca biologica. Un vantaggio importante dei fibroblasti è che non siano portatori di mutazioni in oncogeni e soppressori tumorali e mantenere intatti i punti di controllo del ciclo cellulare. Questo rende fibroblasti normale un sistema preferito per gli studi di regolazione del ciclo cellulare, la riparazione del DNA e l'apoptosi. Il protocollo qui descritto fornisce una ricetta semplice per l'isolame…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM/F12 media		Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified		Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic		Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin		Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade		Roche	05401127001	Replacement enzyme.
				A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 – 10 mg, Cat. no. 05401127001 – 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media		ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel		Multiple suppliers
Three Gas Control incubator		Forma or Heraeus