单分子成像核运输

Summary

单分子显微镜approch成核运输提供了新的见解。

Abstract

实用的单分子荧光显微镜方法已被证明是一个很大的利用理解在过去十年中的生物反应。与细胞内深的高时间分辨率和空间分辨率的分子间相互作用的调查一直具有挑战性的，因为从单个分子所产生的固有的微弱信号。杨等人最近的作品。证明窄场epifluorescence显微镜允许在单分子水平的可视化的核质运输。通过单分子的方法，如核运输的时间和效率的重要动力学，信号依赖和独立的货运分子，已获得。在这里，我们描述的方法途径提高0.4毫秒和12 nm的时空分辨率的协议。提高了分辨率，使我们捕捉到半完整的细胞通过核孔复合物（NPC）在瞬态的主动转运和被动扩散事件。我们期望使用这种方法，在阐明细胞内的其他具有约束力的和贩运活动。

Protocol

1。制备细胞单分子实验系统至少提前一周，从股票开始解冻在37 ° C，在一个25厘米2培养瓶中将用5 mL媒体的HeLa细胞株的新鲜培养，细胞在37 ° C范围内5％的CO 2 24小时的孵化器和分裂，至少有3次，以提供细胞的最佳条件。然而，细胞不应该被分割的20倍以上，由于其增长速度的倾向显着放缓。以前HeLa细胞基因工程有GFP（绿色荧光蛋白）融合到核膜孔膜蛋白的聚甲醛121。这?…

Discussion

必须小心，以确保在实验过程中适当的NE和单分子共定位。同样重要的是提供一个高的信噪比，尤其是当信号为低由于恶劣的标签或漂白。定位精度是有限的背景噪声（焦荧光，CCD读出噪声，暗电流和其他因素引起的）。