Enda molekyl avbildning av kärntransport

Summary

Enda molekyl mikroskopi approch förutsättning nya insikter nukleära transporter.

Abstract

Nyttan av enda molekyl fluorescensmikroskopi metoder har visat sig vara av stor nytta för att förstå biologiska reaktioner under det senaste decenniet. Undersökningen av molekylära interaktioner med hög temporal och spatial upplösning djupt i cellerna har varit utmanande på grund av den inneboende svaga signaler som härrör från enskilda molekyler. Nya produktioner av Yang et al. visat att smala fältet epifluorescence mikroskopi gör visualisering av nucleocytoplasmic transporter vid enda molekyl nivå. Genom den enda molekyl strategi, viktiga kinetik, såsom kärnkraft transporttid och effektivitet för signal-beroende och oberoende last molekyler har erhållits. Här har vi beskrivit ett protokoll för metod med en förbättrad Spatiotemporal upplösning på 0,4 ms och 12 nm. Den förbättrade upplösningen möjligt för oss att fånga övergående aktiv transport och passiv händelser diffusion via nukleära porer komplex (NPC) i semi-intakta celler. Vi förväntar oss att denna metod skall användas belysa andra bindande och människohandel händelser inom cellerna.

Protocol

1. Beredning av cellens system för enda molekyl experiment Minst en vecka i förväg, starta en ny kultur av HeLa cellinje från ett bestånd med upptining vid 37 ° C och sätta i en 25 cm 2 kulturen kolv med 5 ml media, Inkubera cellerna vid 37 ° C inom 5% CO 2 inkubator för 24 timmar och dela det minst 3 gånger för att ge en optimal förutsättning för cellerna. Men cellerna inte bör delas upp mer än 20 gånger på grund av benägenhet för deras tillväxttakten avta avsevärt…

Discussion

Försiktighet måste vidtas för att försäkra en korrekt colocalization av NE och enstaka molekyler under experimentet. Det är också viktigt att ge en hög andel signalbrus, särskilt när signalen är låg på grund av dålig märkning eller fotoblekning. Lokalisering precision är begränsad av bakgrundsljud (som härrör från out-of-fokus fluorescens, CCD avläsning buller, mörka nuvarande och andra faktorer).