विजुअलाइजेशन के intracellular सहभागिता की मात्रा नेइसेरिया meningitidis और Confocal इमेजिंग द्वारा α actinin मानव

Summary

नेइसेरिया (एनएम) meningitidis, एक ग्राम नकारात्मक श्वसन मानव विशिष्ट रोगज़नक़, मानव α-actinin के लिए बाध्य कर सकते हैं . यहाँ हम intracellular मानव मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (HBMECs) में बैक्टीरिया प्रवेश के बाद α actinin के साथ जीवाणु के colocalisation के दृश्य के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

Opc प्रोटीन नेइसेरिया meningitidis (एनएम, meningococcus) के एक सतह व्यक्त अभिन्न बाहरी झिल्ली प्रोटीन, जो एक adhesin और मानव उपकला और endothelial कोशिकाओं के लिए एक प्रभावी invasin के रूप में कार्य कर सकते हैं. हम Opc, एक प्रक्रिया है जो vitronectin जैसे integrin ligands के लिए पहली बाँध के लिए OPC की आवश्यकता के लिए प्रमुख रिसेप्टर्स ^के रूप में और के लिए एक सेल व्यक्त रिसेप्टर्स इन के माध्यम से endothelial सतह स्थित integrins की पहचान की है. इस प्रक्रिया endothelial कोशिकाओं जीवाणु आक्रमण ² की ओर जाता है है . हाल ही में, हम OPC के एक 100kDa मानव ³ कोशिकाओं के पूरे सेल lysates में पाया प्रोटीन के साथ एक बातचीत मनाया . हम शुरू में इस बातचीत मनाया जब मेजबान कोशिका प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग और nitrocellulose पर blotted OPC-व्यक्त एनएम के साथ मढ़ा गया. बातचीत प्रत्यक्ष था और मध्यवर्ती अणुओं शामिल नहीं है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री से, हम α-actinin के रूप में प्रोटीन की पहचान की स्थापना की. के रूप में कोई सतह व्यक्त α-actinin आठ सेल लाइनों की जांच के किसी पर पाया गया था, और लक्ष्य कोशिकाओं में बैक्टीरिया प्रविष्टि के लिए सीरम नेतृत्व की उपस्थिति में endothelial कोशिकाओं के साथ Opc बातचीत के रूप में, हम दो intracellularly बातचीत प्रोटीन की संभावना की जांच की. इस के लिए, सुसंस्कृत मानव मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (HBMECs) से संक्रमित थे Opc व्यक्त विस्तारित अवधि और भली भाँति बैक्टीरिया और α-actinin के स्थानों के लिए एनएम confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई. हम cytoskeletal प्रोटीन है, जो बैक्टीरिया internalisation की एक आठ घंटे की अवधि के बाद काफी था के साथ एनएम के colocalisation में वृद्धि समय पर निर्भर मनाया. इसके अलावा, मात्रात्मक इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग हमें प्राप्त करने के लिए α-actinin और अन्य cytoskeletal प्रोटीन के साथ एनएम के colocalisation के एक रिश्तेदार को मापने के लिए सक्षम होना चाहिए. यहाँ हम दृश्य और मानव endothelial कोशिकाओं में बैक्टीरिया प्रविष्टि के बाद intracellular प्रोटीन के साथ जीवाणु के colocalisation की मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, हालांकि प्रक्रिया भी मानव उपकला कोशिकाओं के लिए लागू है.

Protocol

1. Immunofluorescence प्रोटोकॉल सीडिंग, संक्रमण, और इम्युनो धुंधला हो जाना निम्नलिखित प्रक्रियाओं को उपयुक्त सुरक्षा स्तर टिशू कल्चर और सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रयोगशाला सुविधाओं की आवश्यकता है. 1 दिन ए तैयारी के संक्रमण के लिए लक्ष्य कोशिकाओं कांच coverslips पर 50% (~ 1.5×10 4 कोशिकाओं / सेमी 2) संगम (16 मिमी व्यास) में बीज HBMECs 12 अच्छी तरह से एक थाली (3.8 सेमी 2 विकास क्षेत्र / अच्छी तरह से) में रखा गया है. मध्यम विकास: RPMI 1640 15% गर्मी निष्क्रिय (56 ° सी, 30min) FBS, 2 मिमी glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 100 U / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% (v / v) सदस्य अमीनो गैर जरूरी साथ पूरक एसिड समाधान और% 1 सदस्य विटामिन समाधान. रात (ओ / एन) से अधिक 37 पर संस्कृति ° सी, एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में है . बी बैक्टीरियल संस्कृति ब्याज की तनाव हे / N आवश्यक मध्यम ब्रेन जैसे हार्ट (भी) आसव अगर 37 पर 10% गर्म घोड़े खून के साथ पूरक प्लेटों पर (16-18 ज) विकसित डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 माहौल में 4. दिन 2 बैक्टीरियल सस्पेंशन (एन meningitidis) ए तैयारी एक 10 μL संस्कृति पाश का प्रयोग, 2 एमएल PBSB (पीबीएस कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ) में रात भर जीवाणु संस्कृति के निलंबन बनाते हैं. बड़े बैक्टीरियल समुच्चय निलंबन छोड़ने के लिए कमरे के तापमान (आर टी) में 5 मिनट के लिए खड़े द्वारा व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें. गोली परेशान बिना, एक बाँझ ट्यूब में निलंबन के शीर्ष 1 एमएल (स्टॉक inoculum) हस्तांतरण. शेयर inoculum में बैक्टीरिया की संख्या का अनुमान लगाने के 0.1M NaOH में 1% एसडीएस 1ml मात्रा युक्त ट्यूबों aliquots (2-50 μL) जोड़ सकते हैं और धीरे मिश्रण करने के लिए solubilise. 260nm (A260) absorbance के द्वारा निर्धारित समाधान के न्यूक्लिक एसिड सामग्री उपाय. हमारे हाथ में, 1 संबद्ध A260 5×10 8 कॉलोनी इकाइयों के गठन / एमएल (cfu / एमएल). यह PBSB में शेयर inoculum dilutions की एक श्रृंखला की तैयारी, अगर प्लेट पर बाहर चढ़ाना और / ओ एन ऊष्मायन के बाद कालोनियों की गिनती द्वारा सत्यापित किया जा सकता है है. संक्रमण के माध्यम से शेयर inoculum के एक विभाज्य पतला [decomplemented (M199 2% के साथ पूरक (° सी 30min, 56) सामान्य मानव सीरम (एनएचएस)] के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के संक्रमण के लिए आवश्यक बैक्टीरियल घनत्व प्राप्त करने के लिए. हमारी प्रयोगशाला में, लक्ष्य कक्ष प्रति 200-300 बैक्टीरिया के संक्रमण अनुपात नियमित प्रयोग किया जाता है. बी सेल संस्कृति संक्रमण हांक के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के किसी भी निशान को हटाने के माध्यम से सभ्य लक्ष्य 3 बार कोशिकाओं के साथ coverslips धो लें. 3 घंटे 8 घंटे के लिए हौसले से तैयार जीवाणु (ऊपर वर्णित) 37 ° निलंबन सी के साथ, संक्रमित कोशिकाओं को 5% सीओ 2 में. संक्रमण की अवधि के अंत में, कोशिकाओं पीबीएस के साथ तीन बार धोने और आरटी या / ओ एन में 30-45 मिनट के लिए 2% paraformaldehyde के 500 μL (पीएफए) में ठीक 4 बजे डिग्री सेल्सियस एकाग्रता और ऊपर दिखाए गए समय पर Paraformaldehyde निर्धारण करने के लिए जीवाणु और सेलुलर आकारिकी के संरक्षण के लिए उपयुक्त हो पाया था. से paraformaldehyde धोने के बाद 0.1% Triton एक्स 10 मिनट के लिए 100 पीबीएस में पतला में incubating paraformaldehyde तय कोशिकाओं permeabilise. नमूने पीबीएस के साथ 3 बार धोएं. इम्युनो धुंधला हो जाना करने के लिए आगे बढ़ें या, वैकल्पिक रूप से, 500% 1 / BSA PBST ओ / एन के μL में 4 बजे नमूने छोड़ डिग्री सेल्सियस 3 दिन इम्युनो धुंधला हो जाना बैक्टीरिया के intracellular धुंधला और α-actinin उपयुक्त प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग से sequentially या एक साथ प्रदर्शन कर सकते हैं के रूप में इस प्रकार, सभी प्रक्रियाओं 12 अच्छी तरह प्लेटें में किया जा सकता है. 3% की 500 μL के साथ permeabilised कोशिकाओं से युक्त coverslips ब्लॉक / BSA PBST आरटी पर 30-60 मिनट के लिए (पीबीएस 0.05% युक्त ट्राइटन X-100) पीबीएस से धोने के बाद, 12 अच्छी तरह से थाली में एक नया सूखी अच्छी तरह से प्रत्येक coverslip हस्तांतरण. बैक्टीरिया और α-actinin के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें; coverslip प्रति एंटीबॉडी के अस्सी से 100 μL के लिए पर्याप्त है अगर ध्यान से जोड़ी coverslip की सतह को कवर. कमरे के तापमान पर 1 के लिए सेते हैं. हम नेइसेरिया (प्रयोगशाला उठाया) meningitidis और माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MAB) के खिलाफ खरगोश पॉलीक्लोनल antiserum (Abcam) एक साथ α-actinin के खिलाफ इस्तेमाल किया. कुछ प्रयोगों में, विरोधी α-actinin की जगह में, actin या vimentin के खिलाफ Mabs (सिग्मा) इस्तेमाल किया गया. ऊष्मायन के अंत में, अच्छी तरह से करने के लिए पीबीएस के 200 μL जोड़ने के लिए, और अच्छी तरह से युक्त एक नया 500 μL पीबीएस में coverslip जगह लिफ्ट. 5 मिनट के बाद, पीबीएस pipetting द्वारा हटाने और फिर ताजा पीबीएस जोड़ें. दो बार दोहराएँ. एक को coverslips स्थानांतरणनए सूखी अच्छी तरह से. आरटी पर सेते हैं, उचित माध्यमिक 1% BSA / PBST में विभिन्न पतला fluorochromes को संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए 1 अंधेरे में जोड़ें. बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए, हम विरोधी खरगोश TRITC संयुग्मित पुलिस महानिरीक्षक इस्तेमाल किया और α-actinin और अन्य cytoskeletal प्रोटीन का पता लगाने के लिए, हम विरोधी माउस पुलिस महानिरीक्षक इस्तेमाल संयुग्मित या तो FITC (सिग्मा) या Alexa Fluor 488 (Invitrogen). ऊष्मायन के अंत में, कदम 4 और 5 के रूप में धो लो. आरटी पर 5 मिनट के लिए अंधेरे में 0.6 μg / एमएल DAPI में पीबीएस (डीएनए दाग) के साथ दाग काउंटर. पीबीएस के साथ कुल्ला. बढ़ते मध्यम की एक बूंद के साथ स्लाइड्स (ई, जी Mowiol या Vectashield) पर माउंट coverslips (कोशिकाओं नीचे का सामना करना पड़) अंधेरे में 4 बजे स्टोर डिग्री सेल्सियस नमूने खुर्दबीन के नीचे निरीक्षण के लिए तैयार हैं. 2. Confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) निरीक्षण और intracellular जीवाणु और cytoskeletal तत्वों की छवियों पर कब्जा करने के लिए, हम immunolabelled नमूने और कब्जा कर लिया छवियों Leica SP5-AOBS लेजर confocal स्कैनिंग एक Leica डीएम I6000 उल्टे epifluorescence खुर्दबीन से जुड़ी माइक्रोस्कोप का उपयोग करते थे. सभी छवियों को एक 63x NA 1.4 तेल विसर्जन और Leica सॉफ्टवेयर के साथ उद्देश्य प्रक्रिया का उपयोग कर एकत्र किए गए थे. CLSM प्रक्रिया: CLSM प्रक्रिया शुरू करने के लिए, उद्देश्य के लिए विसर्जन के तेल की एक बूंद को जोड़ने और नीचे coverslip साइड खुर्दबीन मंच पर नमूना, स्लाइड जगह. एक दृश्य मोड के लिए सेट खुर्दबीन और माइक्रोस्कोप के आँख के टुकड़े का उपयोग करते हुए हित के क्षेत्र लगता है. Leica सॉफ्टवेयर का प्रयोग, xyz अधिग्रहण मोड का चयन करें. 512 x 512 (फ्रेम आकार) स्वरूप का चयन करें. Colocalisation पढ़ाई के लिए, उच्च संकल्प, और अधिक सटीक छवि, मन में माइक्रोस्कोप के संकल्प सीमा रखने. फिर द्विदिश एक्स मोड, जो स्कैनिंग गति में वृद्धि होगी का चयन करें और तस्वीर विरंजन को कम करने में मदद. अनुक्रमिक स्कैनिंग सेटिंग्स सेट. "Seq" समारोह में क्लिक करें और स्कैनिंग मोड में से एक चुन. हम मोड "लाइनों के बीच" का उपयोग करें. DAPI (नीला), Fluor Alexa 488 (हरा) और 561 एनएम TRITC के लिए (लाल) के लिए 488 एनएम के लिए 405 एनएम: चुनें लेजर माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित fluorochromes के अनुसार मुस्कराते हुए. Photomultiplier ट्यूब (PMT) 1, 2, और 3, क्रमशः सक्रिय. PMT सेटिंग्स समायोजित करने के लिए सही उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का पता लगाने के लिए. ("शुरू") ऊपर और z-ढेर या श्रृंखला के नीचे ("अंत") सेट. अगला, "z कदम आवश्यक आकार" निर्धारित किया है. नेइसेरिया meningitidis एक diplococcus (चित्र 1G) है और के बाद से प्रत्येक coccus 0.5 सुक्ष्ममापी की एक अनुमानित व्यास है, z कदम का आकार 0.20 सुक्ष्ममापी प्रत्येक coccus में कम से कम दो बार स्कैनिंग की संभावना बढ़ाने के लिए चुना गया था. 0.2 सुक्ष्ममापी – यह 0.1 के इष्टतम समाधान के लिए कदम आकार के भीतर भी है. 3 की लाइन औसतन चयन के लिए शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार के द्वारा अंतिम स्कैन मापदंडों सेट. "शुरू" पर क्लिक करके डबल या ट्रिपल दाग छवियों को अनुक्रमिक स्कैनिंग द्वारा विभिन्न तरंगदैर्य पर प्राप्त कर रहे हैं अलग chromophores के बीच परस्पर बात खत्म. दो fluorochromes के colocalisation का एक संकेत के लिए, "उपरिशायी" समारोह के लिए एक एकल छवि में चयनित चैनल मर्ज का चयन करें, उदाहरण के लिए, जब दोनों 488 Alexa () हरे और TRITC fluorochromes (लाल) colocalise, पीले रंग मढ़ा छवि में दिखाई देगा . Z-ढेर या श्रृंखला संकलित संभव colocalisation visualizing के लिए आवश्यक एक 2d छवि के निर्माण के लिए "अधिकतम प्रक्षेपण" समारोह का उपयोग कर. Colocalisation के अधिक विस्तृत विश्लेषण प्रत्येक ऑप्टिकल अनुभाग के विश्लेषण से प्राप्त किया जा सकता है. Z-ढेर या श्रृंखला को प्राप्त करने के बाद, अपने डेटा की प्रक्रिया के विभिन्न तत्वों के intracellular स्थानीयकरण (चित्रा 1E) के दृश्य के लिए एक orthogonal छवि प्राप्त करने के लिए. 3. Colocalisation की मात्रा का ठहराव Confocal खुर्दबीन स्कैनिंग छवियों के सांख्यिकीय विश्लेषण Volocity सॉफ्टवेयर (कामचलाऊ व्यवस्था, PerkinElmer) के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. यह सॉफ्टवेयर एक colocalisation विश्लेषण के लिए विशेष रूप से डिजाइन के रूप में Manders एट अल (1993) 5 द्वारा वर्णित उपकरण प्रदान करता है. डिजिटल प्रतिदीप्ति इमेजिंग के संदर्भ में Colocalisation वही (पिक्सेल मात्रा) प्रत्येक चैनल में voxel स्थान पर एक संकेत का पता लगाने के रूप में वर्णित किया जा सकता है. दो चैनलों को दो अलग अलग ही नमूना क्षेत्र (Volocity उपयोगकर्ता पुस्तिका) से ली गई है fluorochromes की छवियों से बना रहे हैं. सांख्यिकीय विश्लेषण Volocity सॉफ्टवेयर (कामचलाऊ व्यवस्था, PerkinElmer) मात्रात्मक Colocalisation विश्लेषण नीचे वर्णित का उपयोग कर के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. मात्रात्मक Colocalisation विश्लेषण CLSM Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों के साथ एक पुस्तकालय बनाएँ. शीर्ष पट्टी में छवि से "बढ़ाया ध्यान" का चयन करें. यह उपकरण एक 2d छवि में विश्लेषण किया जा z-ढेर संकलन. "Colocalization" उपकरण का चयन करें. दो चैनलों के लिए विश्लेषण किया जा एक ही रंग गहराई चाहिए. चुनें क्षेत्र है कि यह मात्रा निर्धारित किया जा रहा है. सीमा निर्धारित करने के लिए किसी भी पृष्ठभूमि निकाल के लिए. "Colocalization उत्पन्न" का चयन द्वारा colocalisation उत्पादन बनाएँ. Colocalisation आँकड़े पहले से चयनित हित के क्षेत्रों के लिए उत्पन्न कर रहे हैं. चुनें 'Manders गुणांक (गुणांक ओवरलैप) अनुसंधान और मेरा (colocalisation गुणांक). 'Manders गुणांकों के रूप में वे कुल पिक्सेल तीव्रता के खिलाफ सामान्यीकृत कर रहे हैं धुंधला की तीव्रता के प्रति संवेदनशील नहीं हैं, वे इस प्रकार नियोजित किया जा जब एक प्रतिजन के धुंधला अन्य की तुलना में मजबूत है. 5,6 Manders के अनुसार गुणांक आर ओवरलैप colocalisation के सच की डिग्री का प्रतिनिधित्व करता है, यानी कि पिक्सल की कुल संख्या के साथ तुलना colocalise पिक्सल की संख्या . दूसरी ओर, colocalisation गुणांक, मेरा, अधिक प्रचुर मात्रा में कम प्रचुर मात्रा में आधा भाग (इस मामले बैक्टीरिया में, लाल) के लिए आधा भाग (इस मामले α actinin, हरी में) के प्रतिदीप्ति योगदान का वर्णन है, लाल पिक्सल की संख्या अर्थात् कि लाल पिक्सल की कुल संख्या के साथ तुलना में हरी पिक्सल के साथ ओवरलैप. 'Manders गुणांक 1 और 0 के बीच सीमा, एक उच्च colocalisation, 0 जा रहा है कोई भी जा रहा है के साथ, लेकिन वे आसान व्याख्या के लिए प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जा सकता है. निर्यात डेटा प्रस्तुति के लिए एक एक्सेल दस्तावेज़ के आँकड़े मूल्यों. 4. प्रतिनिधि परिणाम OPC व्यक्त नेइसेरिया meningitidis और α-actinin के intracellular स्थानीयकरण मानव मस्तिष्क microvascular endothelial 3 और 8 के रूप में α-actinin और एनएम जो 3 घंटे संक्रमण प्रयोगों (नहीं दिखाया गया है) में लगातार कम होना को दिखाई के संकेत colocalisation के ऊपर वर्णित घंटे के लिए एनएम के साथ संक्रमित कोशिकाओं के Confocal इमेजिंग 8 घंटे के लिए संक्रमित संस्कृतियों के साथ तुलना में ( चित्रा 1 वायु सेना). Opc व्यक्त meningococci के साथ एक α-actinin के प्रत्यक्ष colocalisation> 5 को दोहराने के प्रयोगों में हर बार मनाया गया. Colocalisation के सांख्यिकीय विश्लेषण कई confocal छवियों का उपयोग कर बाहर किया गया था के रूप में ऊपर वर्णित है. कुल मिलाकर, HBMEC में OPC-व्यक्त meningococci (α actinin) हरे और लाल पिक्सल (एनएम) के> 25% ओवरलैप (चित्रा 2B, गुणांक आर ओवरलैप) प्राप्त हुई थी के साथ संक्रमित. Α-actinin प्रयोगों में जो भली भाँति बैक्टीरिया और या तो actin या vimentin की लेबलिंग का प्रदर्शन किया गया था करने के लिए इसके विपरीत में, कभी कभी colocalisation actin के साथ, लेकिन है कि मनाया गया साथ vimentin दुर्लभ था (Figure. 2B). डेटा भी गुणांक मेरा है, जिसके खाते में प्रत्येक आधा भाग के रिश्तेदार बहुतायत लेता है का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया गया. मेरा अधिक प्रचुर मात्रा में (इस मामले हरे, α actinin में) संकेत हर समय कम प्रचुर मात्रा में संकेत (इस मामले में लाल, बैक्टीरिया) होता है की घटना की आवृत्ति की एक उपाय है. इस उपाय भली भाँति meningococci (चित्रा 2A और सी) के आसपास के क्षेत्र में एक α-actinin की घटना के हड़ताली स्तर से पता चलता है. चित्रा 1. Confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के लिए एन के intracellular बातचीत का आकलन α-actinin साथ meningitidis मुख्यालय. मिला हुआ endothelial coverslips पर हो monolayers Opc व्यक्त एन (वायुसेना) के साथ संक्रमित थे meningitidis. 8 घंटे के बाद, गैर पक्षपाती बैक्टीरिया धुल गया, कोशिकाओं paraformaldehyde के साथ तय की और 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ permeabilised. इसके बाद, बैक्टीरिया और α-actinin के रूप में ऊपर वर्णित दाग थे (α actinin, हरे, बैक्टीरिया, लाल). एसी. एक (ए) एनएम या α actinin (बी) के स्थान के xy छवियाँ दिखा क्षेत्र. ओवरले छवि (सी) में कई क्षेत्रों में जो पीले नारंगी रंग colocalisation सुझाव होता इंगित करता है. में तीर (ए) और (बी) दिखाने के क्षेत्रों में जहां α-actinin संचय के एक उच्च डिग्री करने के लिए बैक्टीरिया के आसपास हुई है प्रकट होता है. डी. एक संक्रमित एक सेल के आधार पर स्थित intracellular जीवाणु के आसपास HBMEC monolayer संकेत colocalisation के ऑप्टिकल विच्छेदन. फिर, इस colocalisation α-actinin के आकस्मिक निकटता की वजह से, नहीं है के रूप में इस क्षेत्र में सामान्य α-actinin के दाग कम है. ई और एफ संक्रमित HBMEC इसके बाद के संस्करण के रूप में संसाधित monolayers के तीन आयामी छवियों. शिखर सतह (ई) का एक परोक्ष दृश्य दाग लाल (लाल तीर) जबकि endothelial कोशिकाओं (पीले तीर) के बेसल सतहों की ओर स्थित कई बैक्टीरिया साफ़ नारंगी / पीले रंग में हैं. पक्षपाती बैक्टीरिया से पता चलता है बेसल स्थान और अधिक स्पष्ट रूप से (एफ) जो एक छोर पर XZ पार अनुभाग में देखा जा सकता है है. एन के एक नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवि जी इसकी दिखा meningitidisसे प्रमुख diplococcal. प्रत्येक coccus व्यास में लगभग 0.5 सुक्ष्ममापी है. चित्रा 2. स्थानीकरण और HBMEC कोशिकाओं में α-actinin, actin और vimentin के वितरण. ए HBMEC के संक्रमित monolayers के रूप में उपरोक्त कथा में वर्णित है लेकिन α-actinin के लिए इसके अलावा में, कुछ coverslips actin या vimentin का पता लगाने के लिए α-actinin के लिए करने के लिए इसी तरह की प्रक्रिया के द्वारा प्रयोग किया गया इलाज किया गया. इसके बाद के संस्करण के रूप में, α-actinin कई भली भाँति बैक्टीरिया (सफेद तीर) के आसपास केंद्रित है. Vimentin और actin प्रशंसनीय स्तर करने के लिए जीवाणु के साथ colocalise नहीं किया. बार 20 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करता है. बी और सी के लिए मान गुणांक अनुसंधान और मेरा अधिक से अधिक तीन Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के रूप में ऊपर वर्णित प्रयोगों से प्राप्त किया गया.

Discussion

के बंधन की संभावना भली भाँति Opc व्यक्त α-actinin नेइसेरिया meningitidis HBMEC का उपयोग कर जीवाणुओं की colocalisation की परीक्षा और 3 और 8 घंटे ऊष्मायन अवधि के बाद संक्रमित कोशिकाओं में cytoskeletal प्रोटीन द्वारा पता लगाया था . Confocal माइक्रोस्कोपी, α actinin साथ नेइसेरिया meningitidis के colocalisation प्रदर्शन किया जा सकता है . विशेष रूप से, हालांकि बैक्टीरिया 3 घंटे में भली भाँति थे, वहाँ इस समय बिंदु पर α actinin साथ थोड़ा colocalisation था. Cytoskeletal प्रोटीन के साथ बैक्टीरियल संघ 8 घंटे संक्रमण अवधि के बाद के रूप में intracellular निवास की एक लंबी अवधि की आवश्यकता होती दिखाई है, जीवाणुओं की महत्वपूर्ण संख्या α actinin जाहिरा तौर पर निकट सहयोग में. अल्फा actinin एक multifunctional प्रोटीन है, और cytoskeletal तत्व के साथ जीवाणु बातचीत लक्ष्य सेल समारोह, जो वर्तमान अध्ययन का एक विषय है पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है.

Colocalisation की मात्रा का ठहराव के रूप में ऊपर वर्णित सावधानीपूर्वक नमूना तैयार करने की आवश्यकता है. नमूना निर्धारण करने के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए, अवधि और एंटीबॉडी dilutions अवरुद्ध. शोर अनुपात करने के लिए सबसे अच्छा संकेत के लिए, प्रत्येक प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी प्रारंभिक प्रयोगों में titrated जाना चाहिए करने के लिए अधिकतम सांद्रता निर्धारित. हमारे अनुभव में, बढ़ते मध्यम Mowiol बेहतर छवियों का उत्पादन किया.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
12 well plate		Corning	BC311
Glass Coverslips		VWR	631-0152
BHI AGAR		LAB M	LAB048
M199		Sigma	M2154
RPMI 1640		Lonza	BE12-167E
MEM Non Essential Aminoacids		Sigma	M7145
HANK’S balanced salt solution		Sigma	H9269
FBS		Biowhittaker	DE14-801F
Glutamine		Sigma	G7513
Sodium pyruvate		Sigma	S8636
Penicillin-Streptomycin		Sigma	P0781
MEM Vitamin solution		Sigma	M6895
PBSB		Lonza	BE17-513F
BSA		Sigma	A9418
Paraformaldehyde		Fisher	P/0840/53
Triton X-100		Sigma	X-100
DAPI		Sigma	D-9564
Vectashield		Vector	H-1000
Mowiol 4-88		Calbiochem	475904
Anti‑Nm antiserum		Laboratory raised		Rabbit serum
TRITC anti-rabbit Ig		Sigma	T6778
Anti α‑actinin mAb [7H6]		Abcam	Ab32816	IgG
Anti actin mAb		Sigma	A4700	IgG2a
Anti vimentin mAb		Sigma	V6630	IgG1
ALEXA FLUOR 488 anti‑mouse IgG		Invitrogen	A11001
FITC anti-mouse IgG		Sigma	F-2012

1. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM):

Leica SP5 confocal imaging system: This system, by using a combination of AOTF (acousto-optical tuneable filter) and an AOBS (acousto-optical beam splitter), simplifies excitation with specific wave lengths.

2-Software:

Leica confocal software LCS, Leica Microsystems, Germany.
Volocity 5, Improvision, PerkinElmer, USA.