Ett snabbt sätt beskrivs att få insikt i strukturen för polysackariderna i ett extracellulärt matrix. Metoden drar nytta av särdragen hos glycosylhydrolases och känslighet masspektrometri tillåta små mängder av material som skall analyseras. Denna teknik kan anpassas för att användas direkt på vävnaden själv.
Den direkta kontakten med celler för miljön förmedlas i många organismer genom ett extracellulärt matrix. En vanlig aspekt av extracellulära matriser är att de innehåller komplexa socker beståndsdelarna i form av glykoproteiner, proteoglykaner och / eller polysackarider. Exempel på den extracellulära matrix av människor och djurceller i huvudsak består av fibrillar proteiner och proteoglykaner eller polysackarid bygger murar cell av växter och svampar, samt proteoglycan / glykolipiden bygger murar cell av bakterier. Alla dessa glycostructures spelar avgörande roller i cell-till-cell och cell-till-miljö kommunikation och signalering.
En extra komplext exempel på en extracellulär matrix finns i väggarna i högre växtceller. Deras vägg består nästan helt av socker, upp till 75% torr vikt, och består av de mest förekommande biopolymerer finns på denna planet. Därför är forskningen hur man utnyttjar dessa material bäst som en koldioxidneutral förnyelsebar resurs för att ersätta petrokemiska härrör från fossila bränslen. Den största utmaningen för bränslekonvertering förblir motspänstighet i väggarna för att enzymatisk eller kemisk nedbrytning på grund av den unika glycostructures som finns i denna unika biokompositmaterial.
Här presenterar vi en metod för snabb och känslig analys av muren växtcell glycostructures. Denna metod oligo Mass profilering (OLIMP) är baserad på enzymatisk frisättning av oligosackarider från väggmaterial underlätta specifika glycosylhydrolases och efterföljande analys av solubilized oligosackarid blandningar med hjälp av matris-assisterad laser desorption / jonisering time-of-flight masspektrometri (MALDI-TOF/MS ) 1 (Figur 1). OLIMP kräver väggar endast 5000 celler för en fullständig analys kan utföras på vävnaden i sig 2, och är mottaglig för hög genomströmning analys 3. Medan det absoluta beloppet av solubilized oligosackarider inte kan fastställas genom OLIMP den relativa förekomsten av de olika oligosackarid joner kan avgränsas från massan spektra ger insikter om ersättning-mönster av den infödda polysackarid som finns i väggen.
OLIMP kan användas för att analysera ett brett utbud av muren polymerer, begränsas bara av tillgången till särskilda enzymer 4. Till exempel, för analys av polymerer som finns i väggen växters cell-enzymer finns tillgängliga för att analysera hemicellulosan xyloglucan med en xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xylan med en endo-β-(1,4)-xylanas 6,7 eller för pektinämnen polysackarider med en kombination av en polygalakturonas och en methylesterase 8. Vidare kan enligt samma principer för OLIMP glycosylhydrolase och även glycosyltransferase aktiviteter övervakas och bestämmas 9.
Den OLIMP metoden som presenteras här ger en mycket känslig och snabb analys av polymerer som finns i det extracellulära matriser. OLIMP kombinerar enzymatiska versionen av oligomerer med påföljande MALDI-TOF-analys. Generering av en MALDI-TOF-spektrum tar mindre än en minut, därav OLIMP är lämplig för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive hög genomströmning studier som mutant skärmar. OLIMP är inte begränsad till fabriken polysackarider, men kan eventuellt användas för ett brett spektrum av polymerer, endast begränsas av tillgången till särskilda hydrolytiska enzymer. Det är dock en begränsning av OLIMP att en absolut överflöd av polymeren inte kan erhållas.
Som tidigare nämnts OLIMP kan användas för att studera strukturen av en mängd olika polysackarider som finns i den extracellulära matrisen av en mångfald av arter. Som ett exempel, utgör Figur 4 en OLIMP spektrum av de stora hemicellulosa i gräsarter, xylan. Här var cellväggen material som härrör från de tempererade gräs Miscanthus upplösas med en xylanas.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av Energimyndigheten biovetenskaper institutets bidrag OO0G01.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water | |
BioRex MSZ 501(D) Resin | BioRad | 142-7425 | ||
Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | ||
Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | ||
3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | ||
Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | ||
MALDI-TOF | Shimadzu BioTech | Axima Performance | ||
MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | ||
SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | ||
Vacuum manifold | Millipore | MSVMHTS00 | ||
Vacuum pump | Welch | DryFast Ultra 2032 |