Una manera rápida se describe para obtener información sobre la estructura de los polisacáridos en una matriz extracelular. El método tiene la ventaja de la especificidad de glycosylhydrolases y la sensibilidad de la espectrometría de masas permite pequeñas cantidades de materiales para ser analizados. Esta técnica se puede adaptar para utilizarse directamente sobre el tejido en sí.
El contacto directo de las células con el medio ambiente está mediada en muchos organismos por una matriz extracelular. Uno de los aspectos comunes de las matrices extracelulares es que contienen restos de azúcar en forma de complejo de glicoproteínas, proteoglicanos, y / o polisacáridos. Los ejemplos incluyen la matriz extracelular de las células animales y seres humanos que consiste principalmente de proteínas fibrilares y proteoglicanos o las paredes de polisacáridos basados en células de plantas y hongos, y los proteoglicanos / glicolípidos paredes de las células base de bacterias. Todos estos glycostructures juegan un papel vital en la célula a la comunicación celular y celular con el medio ambiente y de señalización.
Un ejemplo extraordinario complejo de una matriz extracelular está presente en las paredes de las células de plantas superiores. Su pared está hecha casi en su totalidad de los azúcares, hasta un 75% del peso seco, y se compone de los biopolímeros más abundantes presentes en este planeta. Por lo tanto, la investigación se lleva a cabo la forma de utilizar estos materiales de la mejor manera un recurso renovable de carbono-neutral para sustituir los productos petroquímicos derivados de combustibles fósiles. El principal desafío para la conversión de combustible sigue siendo la obstinación de las paredes a la degradación enzimática o química debido a la glycostructures únicos presentes en este biocompuesto único.
A continuación, presentamos un método para el análisis rápido y sensible de glycostructures la pared celular vegetal. Este método de generación de perfiles Oligo Misa (OLIMP) se basa en la liberación enzimática de oligosacáridos a partir de materiales de la pared para facilitar glycosylhydrolases específicos y posterior análisis de las mezclas de oligosacáridos solubilizados con láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF/MS ) 1 (Figura 1). OLIMP requiere paredes de sólo 5000 células para un análisis completo, se puede realizar en el tejido mismo 2, y es susceptible de análisis de alto rendimiento 3. Mientras que la cantidad absoluta de los oligosacáridos solubilizado no se puede determinar por OLIMP la abundancia relativa de los iones de oligosacáridos diferentes pueden ser definidos a partir de los espectros de masas dando ideas acerca de la sustitución de patrón de los polisacáridos nativos presentes en la pared.
OLIMP se puede utilizar para analizar una amplia variedad de polímeros de la pared, sólo limitada por la disponibilidad de enzimas específicas 4. Por ejemplo, para el análisis de polímeros presentes en las enzimas de la pared celular vegetal se encuentran disponibles para analizar el xiloglucano hemicelulosas con un xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xilano con un 6,7 endo-β-(1-4)-xilanasa , o de polisacáridos pécticas utilizando una combinación de una poligalacturonasa y metilesterasa 8. Además, utilizando los mismos principios de OLIMP glycosylhydrolase e incluso actividades glicosiltransferasa se puede controlar y decidir 9.
El método que aquí se presenta OLIMP permite un análisis muy sensible y rápida de los polímeros presentes en las matrices extracelulares. OLIMP combina la liberación enzimática de oligómeros con posterior análisis MALDI-TOF. La generación de un espectro de MALDI-TOF toma menos de un minuto, por lo que OLIMP es adecuado para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo de alto rendimiento estudios tales como pantallas de mutantes. OLIMP no se limita a los polisacáridos de plantas, pero potencialmente se pueden aplicar a una amplia gama de polímeros, sólo limitada por la disponibilidad de determinadas enzimas hidrolíticas. Sin embargo, una limitación de OLIMP es que la abundancia absoluta del polímero no se puede obtener.
Como se mencionó antes OLIMP se puede utilizar para estudiar la estructura de una variedad de polisacáridos presentes en la matriz extracelular de una diversidad de especies. A modo de ejemplo, la Figura 4 representa un espectro OLIMP de la hemicelulosa en las principales especies de gramíneas, xilano. En este caso, el material de la pared celular derivado de la hierba templada Miscanthus fue digerido con una xilanasa.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por la beca del Instituto de Biociencias de la Energía OO0G01.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water | |
BioRex MSZ 501(D) Resin | BioRad | 142-7425 | ||
Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | ||
Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | ||
3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | ||
Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | ||
MALDI-TOF | Shimadzu BioTech | Axima Performance | ||
MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | ||
SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | ||
Vacuum manifold | Millipore | MSVMHTS00 | ||
Vacuum pump | Welch | DryFast Ultra 2032 |