الجزئي تشريح تقنية explants هو أسلوب قوي وموثوق بها من أجل عزل التكاثري خلايا عضلات الهيكل العظمي من العضلات ، والأحداث أو البالغين الجنينية كمصدر للخلايا الجذعية العظمية العضلية. فريد ، كانت هذه الخلايا المشتقة clonally الهيكل العظمي لإنتاج خطوط الخلايا الجذعية العضلية تستخدم لزرع في الجسم الحي.
مثقف من الاجنة والبالغين خلايا عضلات الهيكل العظمي لديها عدد من الاستخدامات المختلفة. الجزئي تشريح explants تقنية وصفها في هذا الفصل هو وسيلة قوية وموثوق بها من أجل عزل أعداد كبيرة نسبيا من التكاثري خلايا عضلات الهيكل العظمي من العضلات ، والأحداث أو البالغين الجنينية كمصدر للخلايا الجذعية العظمية العضلية. وقد استخدم واضعو الدقيقة تشريح الثقافات يزدرع لتحليل خصائص نمو خلايا العضلات والهيكل العظمي في العضلات من النوع البري والتصنع. كل واحد من مكونات نمو الأنسجة ، يمكن تحليل بقاء الخلية وهي الانتشار ، الشيخوخة والتمايز بشكل منفصل باستخدام الأساليب المذكورة هنا. يمكن تأسيس الأثر الصافي لجميع عناصر النمو من خلال وسائل لقياس معدلات نمو ازدراع. ويمكن استخدام أسلوب الدقيقة يزدرع لإنشاء الثقافات الأساسي من مجموعة واسعة من أنواع مختلفة من العضلات والأعمار ، وكما هو موضح هنا ، وقد تم تكييفه من قبل المؤلفين لتمكين عزلة الجنينية السلائف العضلات والهيكل العظمي.
فريد ، استخدمت الدقيقة يزدرع الثقافات لاشتقاق نسيلي (أصل واحد الخلية) الهيكل العظمي الخلايا الجذعية العضلية (SMSC) خطوط التي يمكن توسيعها واستخدامها في عمليات زرع في الجسم الحي. زرعها في الجسم الحي SMSC تتصرف على النحو الوظيفي ، وأنسجة معينة ، والخلايا الأقمار الصناعية التي تسهم في تجديد عضلة الهيكل العظمي ولكن الألياف التي يتم الاحتفاظ أيضا (في محراب الخلية الأقمار الصناعية) ، ومجموعة صغيرة من الخلايا الجذعية غير المتمايزة التي يمكن إعادة معزولة في الثقافة باستخدام أسلوب الدقيقة ازدراع.
ويمكن استخدام الثقافات يزدرع Microdissected موثوق لعزل السكان وبتكاثر الخلايا التي تحتوي على نسبة عالية جدا (~ 85 ٪) من Myf – 5 التكاثري إيجابية الخلايا الجذعية العضلية الهيكلية (SMSC). في ظل الظروف الثقافة خاضعة لرقابة صارمة وصفها هنا يمكن استخدامها الثقافات يزدرع الأولية لتوصيف سلوكيات نمو SMSC الماوس متحولة وراثيا ، ويمكن استخدامها كوسيلة لتوليد myotubes لتحليل مفصل في المختبر لعمليات المفاضلة. صيانة دقيقة والتلاعب في هذه الثقافات يمكن على المدى الطويل والثقافة ، والتوسع. باستخدام الأساليب المذكورة هنا فإنه من الممكن أيضا أن تستمد نسيلي الجذعية خطوط الخلية العضلية الهيكلية من ثقافات يزدرع عن طريق تخفيف خلية واحدة. لتحقيق انتشار الخلايا وحيدة معزولة أثناء إجراء الاستنساخ ، "متوسطة مشروطة" يستخدم لمحاكاة الشرط الطبيعي من هذه الخلايا لثقافة عالية الكثافة. الأسلوب هو المعمول به (مع التعديل) إلى الأنسجة ، الجنينية الكبار والمسنين البالغين ، وبالإضافة إلى الماوس يمكن استخدامها لعزل خلايا من عضلات الهيكل العظمي من الأنواع الأخرى بما في ذلك الإنسان (راو وسميث ، غير منشورة) ، وأسماك الفرخ الجنين ( سمك السلمون) 24. ويمكن تحليل SMSC المستمدة Clonally في الجسم الحي بواسطة زرع العضلي وتحت هذه الظروف حقن SMSC سوف تتحد مع myotubes المضيف لتشكيل الألياف العضلية الهجين. SMSC حقن العضل لا تشكل الأورام والتي وجدت في العضلات المضيف في موقف الخلية الأقمار الصناعية أكثر من سنة بعد الحقن ، مما يشير إلى أنها تخضع لرقابة الذاتية من قبل الأقمار الصناعية الخلايا الجذعية niche.These الخلية يمكن إعادة معزولة عن حقن كما يستضيف SMSC التكاثري أكثر من 12 شهرا بعد حقن المضيف 19.
The authors have nothing to disclose.
نشكر باتريك Paddison عن هديته للناقلات المكوك shRNAi. ولدت انجيلا سلون صورة رني GFP في الشكل 3. ونشكر أيضا هيئات التمويل التالية لدعمها :
العضلات منح الحملة عدد الضمور RA2/592/2 ؛ الشرر منح عدد 02BHM04 ، عدد الملكي منح جمعية 574006.G503/1948./JE BBSRC ومنح عدد 6/SAG10077.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM/F12 1:1 mix | Sigma-Aldrich Company | Liquid medium: (Dulbecco’s Modified Eagles’s medium and Ham’s F12 medium, 1:1 v/v) | ||
100× Glutamine (200mM) | Sigma-Aldrich Company | Diluted in medium to a 1× concentration of 2 mM (Glutamine HYBRI-MAX R) | ||
Fetal calf serum (FCS) | From a number of different companies | Batch tested on primary cultures and skeletal muscle cell lines. 10-20% supplement to liquid media | ||
Heraeus Labofuge 300 | Heraeus and distributors of Heraeus equipment | Lab centrifuge capable of reaching 1,000 rpm | ||
15 ml Falcon centrifuge tubes | Fisher Scientific | Must fit lab centrifuge | ||
Tissue culture plasticware (25, 75 or 175 mm2 tissue culture vessels; 96-well tissue culture plates. 60 mm Petri dishes). | Nunc (available from Fisher Scientific in the UK) | |||
Humidified CO2 incubator (Heraeus) | Heraeus and distributors of Heraeus equipment | Ours is copper lined, recommended for reducing contamination | ||
Sterile hood with laminar air flow (Heraeus) | Heraeus and distributors of Heraeus equipment | Ours is a Class II hood – suitable for use with Human tissues | ||
Water Bath | Grant Equipment | Maintained always at 37°C | ||
Inverted microscope | Leica DMIRB, Leica Instruments, UK) | |||
70% Ethanol | For sterilization (animals, dissection instruments) and swabbing benches, hood, etc. | |||
Calcium- and magnesium-free phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich Company, UK | Cell culture-tested PBS (Dulbecco’s formula) is purchased as a ready-mixed powder or in tablet form and made up with doubledistilled water before sterilization by autoclave. PBS consists of 2.68 mM potassium chloride (KCl); 1.47 mM potassium phosphate monobasic (KH2PO4); 0.137 M sodium chloride (NaCl); and 8.1 mM sodium phosphate dibasic (Na2HPO4). PBS can be prepared from scratch as follows: 200 mg KCl, 200 mg KH2PO4, 8 g NaCl and 1.15 g Na2HPO4/l of double-distilled water followed by sterilization by autoclave. | ||
CryoTube vials | Nunc (see above) | |||
A Neubauer haematocytometer and coverslips | Fisher Scientific, UK | For estimating cell counting | ||
Hand counter | Fisher Scientific, UK | |||
Dissection microscope, Zeiss Stemi 1000 | Zeiss, UK | For preparation of explants | ||
Small sterile hood | ||||
Sterile dissection instruments (including Jeweler’s forceps) | Sterilised by autoclave | |||
Sterile plastic collecting vessels (7 ml bijou tubes or 20ml universals) | Nunc (Fisher Scientific) | |||
Warm PECM | Constituents purchased from Sigma-Aldrich, UK as above | Made up in the sterile hood and warmed to 37°C in the tissue culture waterbath. DMEM:F-12 supplemented with 20% FCS, 1% glutamine and + 1% penicillin & streptomycin solution | ||
Dispase (50 μg/ml, equivalent to 6 units/mg) | Available from MP Biomedicals, UK | |||
10 μg/ml 4_,6 Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI). | Sigma-Aldrich, UK | For microscopic visualization of apoptosis and mitosis | ||
Vectashield fluorescent mounting fluid | Vector Laboratories, UK | |||
Fluorescent upright microscope with ultraviolet filter (we use a Nikon Eclipse E600) | Nikon, UK | |||
Digital camera and imaging software (we use a Nikon Coolpix 995 camera; A Nikon D3 camera | Nikon, UK | |||
OpenLab4.0a software | Improvision, UK | |||
Photoshop CS4 | Adobe |