Medaka भ्रूण और सेल प्रत्यारोपण के Chimeras की पीढ़ी के लिए Dechorionation

Summary

हार्ड chorion और नरम भ्रूण, medaka भ्रूण के हेरफेर के कारण अधिक zebrafish में से शामिल है. यह वीडियो कैसे medaka भ्रूण में हेरफेर करने के लिए कदम दर कदम प्रक्रियाओं, dechorionation सहित, इमेजिंग और chimeras के उत्पादन के लिए सेल प्रत्यारोपण के लिए agarose में बढ़ते दिखाता है. इन प्रक्रियाओं के लिए एक प्रयोगशाला में medaka और zebrafish का उपयोग करने के लिए हड्डीवाला जीनोम कार्यों की आनुवंशिक विच्छेदन के लिए उनके पूरक सुविधाओं का पूरा लाभ लेने के लिए आवश्यक हैं.

Abstract

Medaka एक छोटे से अंडे बिछाने मीठे पानी मछली है कि दोनों आनुवंशिक और embryological विश्लेषण की अनुमति देता है और एक तीन हड्डीवाला मॉडल जीवों में जो जीनोम चौड़ा phenotype ^{संचालित} उत्परिवर्ती स्क्रीन बाहर 1 किए गए है. Medaka और zebrafish के बीच संबंधित जीन की कार्यात्मक ओवरलैप के विचलन उपन्यास phenotypes कि एक ^एकल 2 प्रजातियों, इस प्रकार medaka और zebrafish हड्डीवाला जीनोम कार्यों की आनुवंशिक विच्छेदन के लिए पूरक हैं में unidentifiable रहे हैं की पहचान की अनुमति देता है. Dechorionation जैसे medaka भ्रूण, इमेजिंग और कोशिका प्रत्यारोपण के लिए बढ़ते भ्रूण की हेरफेर कुंजी प्रक्रियाओं के लिए एक प्रयोगशाला में दोनों medaka और zebrafish पर काम कर रहे हैं. सेल प्रत्यारोपण medaka परिवर्तन के सेल स्वायत्तता की जाँच. Chimeras unlabeled प्राप्तकर्ता भ्रूण में दाता भ्रूण से लेबल कोशिकाओं के प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. दाता कोशिकाओं प्राप्तकर्ता भाग्य ³ नक्शे के आधार पर इतना है कि प्रतिरोपित कोशिकाओं से क्लोन विकास के दौरान ब्याज की ऊतक में एकीकृत किया जा सकता है है भ्रूण के विशिष्ट क्षेत्रों में प्रतिरोपित किया जा सकता है. हार्ड chorion और नरम भ्रूण, medaka भ्रूण के हेरफेर के कारण अधिक zebrafish में से शामिल है. इस वीडियो में, हम विस्तृत medaka भ्रूण हेरफेर प्रक्रियाओं दिखा.

Protocol

1. भ्रूण के विकास जब वे निर्धारित कर रहे हैं, अंडे chorion पर अनुलग्नक filaments के कारण clustered रहे हैं. भ्रूण सामान्य रूप से विकसित करने के लिए, यह अलग अंडे करने के लिए आवश्यक है. उलझन और दो संदंश के साथ लगाव के filaments पकड़े द्वारा लगाव filaments में कटौती. Unclustering के बाद, अंडे मल और शैवाल से अलग हो रहे हैं और 6cm पेट्री डिश 40 प्रति अंडे की एक अधिकतम घनत्व पर ताजा भ्रूण माध्यम से स्थानांतरित. Medaka भ्रूण 27 पर थोड़ा zebrafish की तुलना में धीमी विकसित ° सी. अंडे सेने के समय दो प्रजातियों के बीच भिन्न है, medaka भ्रूण 7 दिनों में chorion से पक्षियों के बच्चे और तुरंत तैरना और खाने के लिए शुरू, जबकि zebrafish भ्रूण 2 दिनों में पक्षियों के बच्चे हैं लेकिन तैरना और 5-6 दिनों में खाने के लिए शुरू. Medaka के विकास Iwamatsu मचान 4 अनुसार मंचन किया जाता है. medaka भ्रूण के विकास आसानी से उपयुक्त तापमान का चयन करके प्रयोगात्मक योजनाओं को समायोजित किया जा सकता है. Medaka भ्रूण के विकास के प्रारंभिक विकास में 4 ° C पर रोका जा सकता है. 24 चरण के बाद जब दिल की धड़कन शुरू होता है, विकास के लिए 18 की एक न्यूनतम तापमान डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर धीमा किया जा सकता है medaka somitogenesis में यानी अंगों / ऊतकों की उपस्थिति के समय medaka में थोड़ा अलग zebrafish के साथ तुलना में मस्तिष्क के विकास की शुरुआत के बाद होता है जबकि zebrafish somitegenesis में मस्तिष्क के विकास से पहले. 2. Chorion हटाना medaka के chorion एक कठिन भीतरी परत और एक नरम बाहरी सतह के साथ दो सुरक्षा परतों के होते हैं. इस प्रकार, एक protease दो कदम उपचार pronase और अंडे सेने के एंजाइम को रोजगार इस chorion निकालना आवश्यक है. एक बार dechorionated, भ्रूण 1X बीएसएस में रखा जाना चाहिए. अर्ध बाँझ परिस्थितियों dechorionated भ्रूण की सफल संस्कृति को बढ़ाने के लिए, खासकर जब अवलोकन के लंबी अवधि के लिए आवश्यक हैं. ये बाँझ (जैसे एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 1X बीएसएस निष्फल) समाधान और उपकरणों 1X बीएसएस के साथ rinsing के बाद 70% इथेनॉल के साथ निष्फल का उपयोग कर शामिल हैं. Dechorionated medaka भ्रूण के रूप में नरम और dechorionated zebrafish भ्रूण से अधिक कमजोर हैं, अतिरिक्त देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें के लिए वे या पिपेट में हवाई बुलबुले से संपर्क नहीं करते हैं, के रूप में इस तत्काल पतन का कारण होगा करने के लिए लिया जाना चाहिए. भ्रूण को कम से कम क्षति सुनिश्चित करने के विंदुक पंप के साथ एक चौड़े मुँह की गर्मी पॉलिश कांच विंदुक स्थानांतरित भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा चाहिए और एक बाल पाश के अवलोकन के लिए भ्रूण मालूम उपयोग किया जाना चाहिए. गैर पक्षपाती पेट्री डिश सतहों के लिए संलग्न करने से भ्रूण को रोकने के लिए किया जाना चाहिए. यह dechorionation के लिए पहले जाँच की जानी चाहिए कि अंडे गया पर्याप्त अलग कर दिया है और साफ अप. चूंकि दोनों pronase और अंडे सेने एंजाइमों proteinases हैं, वे बर्फ पर रखा होना चाहिए और इन एंजाइमों के लिए भ्रूण के जोखिम को कम. Sandpaper (p2000 धैर्य आकार, निविड़ अंधकार) एक 9cm पेट्री डिश के ढक्कन में रखा अंडे स्थानांतरण. अतिरिक्त मध्यम निकालें लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त मात्रा के रूप में भ्रूण की सुखाने को रोकने के लिए बनी हुई है. धीरे आसपास में 45-60 सेकंड के लिए भ्रूण का रोल करने के लिए कुछ बाहरी सतह बाल हटाने और हल्के chorion की सतह (चित्रा 1) स्कोर. भ्रूण वापस मूल पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण और जांच. जब sandpaper पर रोलिंग भ्रूण तर्जनी का उपयोग करें, कम से कम दबाव लागू करने और उंगली समानांतर रेत कागज की सतह रखने. एक बार में 5-7 भ्रूण से अधिक मत रोल. इस एहतियात एक दूसरे के नीचे कुचल भ्रूण के जोखिम को कम कर देंगे. 20mg/ml और 40-60 मिनट के लिए pronase सेते भ्रूण के साथ पकवान में 27 अंडे मध्यम बदलें डिग्री सेल्सियस सुनिश्चित भ्रूण पर्याप्त pronase द्वारा कवर कर रहे हैं और एक ढक्कन के पकवान पर मौजूद है. अप्रयुक्त pronase इस कदम कम से कम आत्म पाचन के दौरान बर्फ पर रखा जाना चाहिए और जब तक गतिविधि खो दिया है (लगभग 1-2 सप्ताह) reused किया जा सकता है. पुन: उपयोग और धोने भ्रूण मध्यम में 5X pronase के निशान हटाने के रूप में इस अंडे सेने के एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए जोड़ दिया जाएगा भ्रूण के लिए pronase पुनर्प्राप्त. अंडे सेने के एंजाइम के साथ भ्रूण मध्यम और कवर भ्रूण निकालें, सुनिश्चित करने भ्रूण पकवान में एक monolayer के रूप में बैठते हैं. यदि अंडे डिश में एक दूसरे के शीर्ष पर बैठते हैं, नीचे में उन लोगों के रूप में chorion घुल कुचल दिया जाएगा. बर्फ पर अप्रयुक्त सेने एंजाइम रखें. 27 में भ्रूण सेते डिग्री सेल्सियस और 15 मिनट के बाद समय – समय पर एक अंडे सेने का उपयोग stereomicroscope की प्रगति की जाँच करें. यह देखा जा सकता है कि चंद्र खड्ड की तरह छेद के एक नंबर chorion की भीतरी परत है, जो जल्द ही यह chorion नरम बाहरी परत आसानी manuall हटा निम्नलिखित छोड़ने घुल में आने लगते हैंवाई सेने की पूरी प्रक्रिया 15-60 मिनट लग सकते हैं. जैसे ही के रूप में भ्रूण chorion से बाहर आ, एक पेट्री 1X बीएसएस युक्त डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण. बीएसएस भ्रूण धीरे बाहर रोल करने के लिए अनुमति देता है की सतह पर पिपेट की नोक छू द्वारा सेने एंजाइम नहीं 1X बीएसएस हस्तांतरण सुनिश्चित करें. एक बार सभी भ्रूण सेने एंजाइम से स्थानांतरित कर रहे हैं, 1X बीएसएस के एक ताजा पकवान अंतिम हस्तांतरण बनाते हैं. यह सुनिश्चित करता है भ्रूण सेने एंजाइम की किसी भी अवशेष को उजागर नहीं कर रहे हैं के रूप में यह उजागर भ्रूण नुकसान होगा. एक बार इस अंतिम पकवान में किसी भी अभी भी chorion की बाहरी परत रखने भ्रूण मैन्युअल मुक्त हो stereomicroscope तहत निष्फल – सूक्ष्म संदंश का उपयोग कर सकते हैं. यदि भ्रूण निम्नलिखित dechorionation विकसित करने की आवश्यकता है, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन बीएसएस के लिए जोड़ा जाना चाहिए बैक्टीरियल वृद्धि को रोकने के. चित्रा 1 लुढ़का और unrolled भ्रूण के dechorionation दौरान तुलना. निरीक्षण कैसे पैनल बी में लुढ़का भ्रूण पैनल ए में unrolled भ्रूण पर देखा बाल की कमी 3. बढ़ते dechorionated भ्रूण Agarose एम्बेडिंग इमेजिंग के अब जीना भ्रूण के लिए अवधि (जैसे समय व्यतीत इमेजिंग) के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तय भ्रूण की विस्तृत टिप्पणियों के लिए उपयोगी है. Gastrulation और जल्दी organogenesis (28 चरण के लिए 14 चरण) के दौरान, medaka भ्रूण periderm, एक ऊतक परत को कवर दोनों विकासशील भ्रूण और जर्दी 5 भर में लयबद्ध सिकुड़ा आंदोलनों की लहरों दिखा रहे हैं. भ्रूण 3.5mm 1-heptanol के साथ व्यवहार कर रहे हैं सिकुड़ा आंदोलनों 6 रोक . 28 चरण (64hpf) के बाद भ्रूण की आवाजाही रोकने के लिए, भ्रूण एम्बेड पहले Tricaine mesilate (टीएमएस) की बूँदें जोड़कर anaesthetized हैं. टीएमएस agarose भी जोड़ा जाता है (केवल एक न्यूनतम राशि को जोड़ने के लिए, इस खुराक के लिए अनुकूलित किया है, लगभग एक 1:25 कमजोर पड़ने की जरूरत है). 37 के लिए हीटिंग डिग्री सेल्सियस और इस तापमान पर बनाए रखने के द्वारा 3% कम gelling तापमान agarose (1X बीएसएस में) की एक छोटी राशि पहले गला लें. लिए निम्न चरणों का बाहर किया जा तेजी से करने के लिए सुनिश्चित करें कि agarose भ्रूण orientating से पहले जमना नहीं करता है की जरूरत है. एक चौड़े मुँह ग्लास विंदुक पर्याप्त पिघला हुआ agarose हस्तांतरण का उपयोग करने के लिए एक Eppendorf ट्यूब के टोपी अवसाद भरने. टोपी भ्रूण के साथ बीएसएस से अधिक ले जाने के कम से कम अवसाद के एक dechorionated भ्रूण स्थानांतरण. तुरंत तेज agarose और टोपी अवसाद और एक पेट्री डिश संस्कृति कक्ष के लिए स्थानांतरण से भ्रूण. तल पर एक कांच की खिड़की के साथ एक 3.5cm पेट्री डिश में प्रयोग किया जाता है. एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के इमेजिंग के लिए, भ्रूण केंद्रित शरीर facedown कर रहे हैं और कवर कांच के लिए बंद रखा. इमेजिंग के लिए एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग agarose की मोटाई कम से कम है. 14cm व्यास पेट्री पकवान युक्त बर्फ और पानी (1 / 3 मोटे तौर पर बड़े पकवान की कुल गहराई के लिए भरा पानी) में 3.5cm पेट्री डिश स्थानांतरण. Whilst कक्ष 14cm पेट्री डिश के तल पर मजबूती से नीचे पकड़े, एक बाल पाश का उपयोग करने के लिए धीरे भ्रूण मालूम पिघला हुआ agarose में वांछित के रूप में भ्रूण और पकड़ जब तक agarose धीरे से ऊपर उठाने और कम अपनी मूल स्थिति के लिए छोटे पकवान द्वारा solidifies बर्फ के ठंडे पानी में. 4. Medaka भ्रूण में सेल प्रत्यारोपण इस प्रक्रिया के लक्ष्य निर्धारित करने के लिए है कि ब्याज की जीन एक कोशिका के भीतर सेल autonomously या गैर सेल autonomously (कोशिकाओं के बीच) में कार्य करता है है. दाता कोशिकाओं rhodamine-dextran जैसे एक अनुरेखक प्रत्यारोपण करने से पहले डाई (के रूप में साथ जौव प्रोटोकॉल Medaka भ्रूण की Microinjection 'में उल्लिखित) या GFP अभिव्यक्ति के साथ एक ट्रांसजेनिक तनाव का उपयोग किया जा सकता है के साथ लेबल किया जा सकता है, प्रत्यारोपण के मूल्यांकन की अनुमति है. दोनों लेबलिंग तकनीकों का एक संयोजन अक्सर ऑटो प्रतिदीप्ति कि सामना किया जा सकता है पर काबू पाने के लिए उपयोगी है. समय चूक प्रत्यारोपण के बाद पढ़ाई के लिए, GFP अभिव्यक्ति विशेष रूप से उपयोगी है. एक चौड़े मुँह ग्लास विंदुक विंदुक पंप के साथ इस प्रक्रिया के दौरान प्रयोग करें और 70% EtOH के साथ सभी (स्लाइड्स सहित) पहले से उपकरण बाँझ पूरी तरह से बाँझ 1X बीएसएस के साथ rinsing द्वारा पीछा किया. प्राप्तकर्ता भ्रूण आम तौर पर लगभग 12 चरण के लिए विकसित कर रहे हैं के रूप में इस उदर और पृष्ठीय डंडे जब प्रत्यारोपण बाहर ले जाने की भेदभाव की अनुमति देता है. भ्रूण dechorionating 1.5 घंटे और एंजाइम incubations के दौरान सेटअप इंजेक्शन तंत्र प्रत्यारोपण करने से पहले शुरू. एक 9cm व्यास पेट्री डिश में एक गुहा खुर्दबीन स्लाइड रखें. </li> गुहा एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग कर स्लाइड के केंद्र के लिए 3% methylcellulose की एक छोटी राशि जोड़ें और बारीकी से फैल. लगभग 1-2 मिनट के लिए सूखी methylcellulose. बाँझ 1X बीएसएस के 350μl जोड़ें स्लाइड अवसाद को भरने के लिए. एक गिलास पिपेट का उपयोग स्लाइड के लिए एक दाता भ्रूण और चार प्राप्तकर्ता भ्रूण स्थानांतरण. ओर मालूम एक बाल पाश का उपयोग तो भ्रूण के blastoderm ऊपर का सामना करना पड़ रहा है भ्रूण. भ्रूण प्रत्येक आगे बढ़ाने स्थिरता के लिए अन्य के खिलाफ leant जा सकता है. धीरे दाता blastoderm और धीरे – धीरे तेज 10-20 कोशिकाओं में सूक्ष्म सुई सम्मिलित करें. धीरे प्राप्तकर्ता भ्रूण blastoderm के आवश्यक क्षेत्र में सुई डालने और कोशिकाओं को धीरे से निष्कासित. महान देखभाल जब प्राप्तकर्ता blastoderm में कोशिकाओं डालने इतनी के रूप में बाधित करने के लिए नहीं सेल की जर्दी थैली सीमा के रूप में इस भ्रूण की मौत में परिणाम होगा करने के लिए लिया जाना चाहिए. पेट्री डिश में निष्फल 1X बीएसएस डालो. ध्यान से पकवान में बीएसएस डाल के रूप में संभव के रूप में पकवान की तरफ से करीब इतनी के रूप में बाधित नहीं भ्रूण. कभी भ्रूण पर डाल सीधे बीएसएस और पर्याप्त ऐसी है कि स्लाइड और भ्रूण डूब रहे हैं बीएसएस जोड़ें. पकवान और कवर करने के लिए पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन / 100μl जोड़ें. ध्यान से एक 27 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पकवान स्थानांतरण करने के लिए सामान्य विकास की अनुमति. भ्रूण समय – समय पर देखा जा सकता है के रूप में वांछित है. जब प्रत्यारोपण का उपयोग कर लाभ के समारोह और / या phenotype बचाव प्रयोगों के लिए बाहर ले जाने, कुछ morphological परिवर्तन मनाया प्रत्यारोपण के प्रभाव के कारण हो सकता है. इस प्रकार कई प्रत्यारोपण आवश्यक हैं. 2-3 दिनों के बाद, melanophores जर्दी थैली, सिर, आँखें और ट्रंक पर मौजूद होना चाहिए. यदि प्रतिरोपित भ्रूण पर मौजूद तो एक सफल कल्पना सबसे अधिक संभावना का उत्पादन किया गया (चित्रा 3). यदि आवश्यक पीसीआर (ओं) ट्यूब 55 ° सी 4 94 पर 10 मिनट के द्वारा पीछा किया घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस और बाहर ले पीसीआर. 20mg/ml proteinase लालकृष्ण सेते 25μl युक्त स्थानांतरित जीनोटाइप दाता भ्रूण (ओं) 5. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2. Agarose एम्बेडेड एक भ्रूण का उदाहरण की स्थिति . पूर्वकाल सही करने के लिए दिखाया गया है दृश्य और पृष्ठीय है. पैनल बी: endothelial कोशिकाओं भ्रूण शरीर के दोनों तरफ देखा जा सकता है और FLI प्रमोटर द्वारा संचालित GFP लेबल का उपयोग कर रहे हैं. चित्रा 3 – प्रत्यारोपण के बाद भ्रूण की छवियाँ . छवि एक दाता और प्राप्तकर्ता भ्रूण के प्रत्यारोपण के बाद तुरंत पता चलता है. दाता भ्रूण सही पर एक पूरी तरह से लाल blastoderm (तीर) के साथ दिखाया गया है. प्राप्तकर्ता भ्रूण बाईं तरफ के दिखाया है और आसानी से blastoderm (arrowhead) में दिखाई लाल प्रतिरोपित कोशिकाओं के छोटे जन द्वारा की पहचान की है. छवि बी दो प्राप्तकर्ता भ्रूण से पता चलता है लगभग 7 घंटे के बाद प्रत्यारोपण (27 डिग्री सेल्सियस पर incubated). सूचना प्रतिरोपित कोशिकाओं के प्रत्यारोपण की साइट से चले गए हैं और अब blastoderm (तीर) भर में बिखरे. छवि सी st.29 (74hpf लगभग) पर एक प्राप्तकर्ता भ्रूण से पता चलता है. आंख और ट्रंक और मस्तिष्क क्षेत्र (तीर) में melanophores की उपस्थिति में pigmentation के नोट. rhodamine-लेबल कोशिकाओं भ्रूण कल्पना के सफल उत्पादन का संकेत संरचनाओं के कई बस्तियां देखा जा सकता है.

Discussion

हम इस वीडियो में प्रदर्शन कैसे dechorionate और medaka भ्रूण सेल transplanataion पर बाहर ले. यह chimeric भ्रूण विकास के दौरान जीन / प्रोटीन समारोह का अध्ययन, साथ ही जीन / प्रश्न में प्रोटीन की स्वायत्तता elucidating के लिए के लिए उत्पादन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. Medaka यह अच्छी तरह से स्थापित भाग्य नक्शे और vivo इमेजिंग वास्तविक समय में उनकी पारदर्शिता उधार उन्हें अच्छी तरह से करने के लिए कारण तकनीक के लिए एक उपयोगी हड्डीवाला मॉडल प्रणाली रहे हैं. ट्रांसप्लांटेशन (के रूप में साथ जौव प्रोटोकॉल 'Medaka भ्रूण की Microinjection में उल्लिखित) तो microinjection है कि प्रतिरोपित कोशिकाओं के व्यवहार को आसानी से देखा जा सकता है है के साथ संयुक्त किया जा सकता है है.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Embryo medium	Reagent	Made in-house	N/A	200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)
Micro-dissecting forceps	Tools	55 INOX A.DUMONT&FILS	N/A	Very sharp fine tips for removal of chorion.
Fine waterproof sandpaper – p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.	N/A	Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
3% methylcellulose	Reagent	Sigma	M 0512	High viscosity for holding embryos in place during transplantation.
1X BSS	Reagent	Made in-house	N/A	20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.
Penicillin-streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122	Added to BSS when incubating dechorionated embryos.
Pronase	Reagent	Calbiochem	53702	For dechorionation.
Hatching enzyme	Reagent	Made in-house	N/A	For dechorionation.
Tricaine mesilate (TMS)	Reagent	Sigma	A-5040	400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.
3% ultra-low gelling temp. agarose	Reagent	Sigma	A-2576	Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.
Petri dish culture chamber	Tool	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	11-004-008	Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.
Micromanipulator	Equipment	Narishige	N/A	Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10T	For making transplantation needles.
Flaming/Brown micropipette puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Model P-97	For making transplantation needles.