Biz sürekli fare mikroglia görselleştirme ve dolaşımdaki monositler için bir yöntem tarif<em> In vivo</em> Transkraniyal iki foton mikroskopi kullanılarak saat, gün veya hafta içinde. Biz HIV-1 düzenleyici protein Tat komşu stereotaktik enjeksiyonu ile aktif hale getirilebilir latent mikroglia aralıklı gözlem sağlar seyrelmiş bir kafatası pencere nasıl hazırlanacağını gösteriyor.
Geleneksel nörobilim in vivo fare ve merkezi sinir sisteminin iki foton görüntüleme veya açık kafatası 1,2 veya 3 hazırlıkları inceltilmiş-kafatası yer vardır . Açık kafatası tekniği çok yönlü olmakla birlikte invazif ve mikroglial aktivasyon neden olabileceğinden, mikroglia eğitim için optimal değildir. Inceltilmiş kafatası yaklaşım minimal invaziv olmasına rağmen, kronik görüntüleme için gerekli kafatasının yeniden inceltme tekrarlanan doku hasarı ve mikrogliyal aktivasyon riskleri artırır ve görüntüleme oturumları sınırlı sayıda sağlar. Burada iki foton mikroskopi kullanılarak zaman uzun bir süre boyunca in vivo fare mikroglia izlenmesi için kronik bir kafatası ince pencere yöntemi mevcut. Biz istikrarlı, erişilebilir, inceltilmiş kafatası kortikal pencere (TSCW) aralıklı gözlem üç hafta boyunca yarı saydam kalır bir apposed cam lamel nasıl hazırlanacağını gösteriyor. Bu TSCW hazırlık, çok daha inceltme açık kraniotomi veya tekrarlanan kafatası daha mikroglia aktivasyonu açısından immünolojik asal keyfi bir görüntüleme oturumları sayısı ve haftalık bir süre içinde sağlar. ≤ 150 mm pial yüzeyinin altında gelişmiş yeşil flüoresan protein ile mikroglia görselleştirmek için CX 3 CR 1 GFP / + fareler 4 TSCW hazırlar. Biz de bu hazırlık dayanıklı microgliosis tetikleme kapasitesine sahiptir TSCW bitişik Tat HIV-1 nörotoksik protein, stereotaktik beyin enjeksiyonları ile birlikte kullanılabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, bu yöntem, HIV Associated Nörobilişsel Bozukluğu (EL) ve yöntemine işaret bileşeni ile diğer nörodejeneratif hastalıklar modelleri canlı beyin zamanla mikrogliyal morfoloji ve motilite değişiklikleri incelemek için son derece yararlı.
HIV-1 ile ilişkili bilişsel açıkları (EL) için gerçek bir substrat muhtemelen HIV-1 mononükleer fagositler serbest pro-inflamatuvar mediatörlerin neden olduğu yıkım, sinaptik mimarisi olduğunu artan bir fikir birliği yoktur. Mikroglia aktivasyonu, çok çekirdekli dev hücreler ve astrositik hipertrofisi nedeniyle gliozis 7 CNS HIV-1 enfeksiyon ve enflamasyonun nonspesifik işaretlerinden kabul edilir. Buna karşılık, sinaptik karmaşıklığı kaybı, CNS 8,9,10,11 makrofaj yükünün yanı sıra premortem nörolojik hastalığın şiddeti ile korele edilmiştir. Ancak, mikroglia, periferik infiltre eden makrofaj ve EL ile hasta nöronlar arasındaki dinamik etkileşimler sadece geleneksel immünositokimyasal çalışmalarda elde edilen geleneksel statik işleme kullanarak modellenebilir olamaz. Laboratuarlarımızda Son çalışmalar, periferik ve santral mononükleer hücreleri ve nöronlar arasındaki bu etkileşimlerin en azından bazı HIV-1 proteininin Tat 1-72 stereotaktik beyin parankiminin (Lu, Marker, Tremblay, içine enjeksiyon bölümünde modellenebilir olduğunu ileri sürmüşlerdir Qi ve Gelbard, yayınlanmamış veri). Bu nedenle, neuroAIDS için izlenebilir küçük bir hayvan modeli, in vivo iki foton görüntüleme monosit kökenli makrofajlar, beyin ikamet mikroglia ve nöronlar arasındaki etkileşimi incelemek için uygulamaya karar verdi . Açık-kafatası ya da inceltilmiş-kafatası hazırlıkları zaman bir kısa bir süre (saat) kortikal mimari bir tek muayene, subakut olaylar zaman elbette artifactually, cerrahi manipülasyon nedeniyle mikroglia / makrofaj aktive olmadan bu hazırlıkların kullanmak değil. Ilgilenen Alan İnceleme göze iken kalvarial pencere. Burada basit bir şekilde yapıştırma TSCW yenileyici kalvaryumda önlemenin yanı sıra ≥ 3 hafta translusensi sağlamak cam lamel inceltilmiş kafatası alan üzerinde küçük bir parça bu sınırlama engellemeyi göstermektedir. Biz daha bu tekniği bize (CX 3 CR 1 / GFP için heterozigot farelerin korteks HIV Tat 1-72 stereotaktik enjeksiyon yanıt yanı sıra beyin-yerleşik mikroglia beyin mikrovasküler giren periferik monositler davranışlarını izlemek için izin verdiğini göstermek mononükleer soy hücreleri belirlemek için). Bu teknik, farklı genetik geçmişleri olan fareler üzerinde kullanmak için kolayca adapte olabilir, örneğin, rutin heterozigot CX 3 CR 1 / GFP kullanmak X Thy-1, monosit kökenli makrofajlar, beyin ikamet mikroglia ve nöronlar arasındaki etkileşimi araştırmak için YFP 12 fareler EL ile ilgili nöro in vivo modeller. Bizim TSCW hazırlanması, araştırmacılar, çevre ve hayvan deneysel tedavi öncesi ve sonrasında sürekli görüntülü hangi hafta süreleri, üzerinde oluşabilir MSS arasında hücre-hücre etkileşimleri çalışma sağlar. Böylece, her hayvan, kendi kontrolü olarak hizmet verebilir. Bu TSCW model için bir ihtar soruşturma kapsamında hedef hücreleri ya genetik olarak geliştirilmiş floresan proteinleri (eXFP) ifade veya kalvaryumda mekanik ihlali olmadan bir floresan boya ile etiketlenmiş tasarlanmıştır gerektiğini ve bu eXFP ifade yeterince güçlü olmalıdır haftalık bir süre içinde tekrarlanan görüntüleme seans sonrası hücresel mimarisi görüntülenmiştir izin.
The authors have nothing to disclose.
Emily A. Kara kafa plaka tasarımı için teşekkür ederim.
NIH ödül HAG destek için minnettarız: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 ve bu işi mümkün olmazdı onsuz Geoffrey Waasdorp Pediatrik Nöroloji Fonu cömert desteği. AKM Ulusal Sağlık Enstitüsü, (EY019277), Whitehall Vakfı, Alfred P. Sloan Vakfı ve Kariyer Ödülü Burroughs Wellcome Fonu Biyomedikal Bilimler tarafından finanse edilmektedir. MET Viyana de la recherche tr Sante du Quebec (FRSQ) doktora sonrası eğitim ödülü tarafından finanse edilmektedir. DFM NIH, T32 GM07356 ve T32 AI049815 tarafından finanse Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı, bir stajyer.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |