可视化的细胞与细胞转移的艾滋病毒，艾滋病毒和现场共聚焦显微镜的荧光克隆

Summary

这种可视化的实验是利用荧光艾滋病毒的分子克隆，现场共聚焦成像实验的指导。

Abstract

他们最喜爱的蛋白质的绿色荧光蛋白融合，生物学家现在有学习能力，生活复杂的细胞过程中使用荧光视频显微镜。要跟踪人类免疫缺陷病毒核心蛋白在细胞与细胞的人类免疫缺陷病毒的传播运动，我们有GFP标记的Gag蛋白中的一种感染艾滋病毒的分子克隆的情况下，被称为艾滋病毒GAG – iGFP。我们研究这种病毒的克隆，使用视频共聚焦显微镜。我们在下面的可视化实验，转染人类与艾滋病毒GAG – iGFP的T细胞系，我们用荧光标记的未受感染的CD4 + T细胞作为靶细胞病毒。使用不同的荧光标记，我们可以很容易地按照病毒的生产和运输跨间结构称为病毒学突触。简单透氧成像商会让我们从几分钟到几天的现场共聚焦显微镜观察的突触。这些方法可用于跟踪病毒的蛋白质，因为他们移动从一个细胞到下一个。

Protocol

使用这种方法是在报告的研究夜蛾等科学323：1743年至1747年（2009年） 。 1。概述原是感染艾滋病毒的Jurkat细胞作为供体细胞和主要的CD4 + T淋巴细胞受体细胞1,2,3描述的细胞与细胞的艾滋病毒的蔓延。在这些研究中，使用抗体染色的固定细胞中检测到病毒。为了追踪病毒在活细胞中的细胞从细胞的转移，我们利用重组，传染病艾滋病毒的分子克隆称为艾滋病毒 GAG – iGFP 4。它携带绿色荧光蛋白（GFP）的内部插入MA和CA域之间的Gag蛋白。这对艾滋病毒的分子克隆保留而不需要辅助病毒的传染性。从这个克隆的病毒颗粒是化学计量装有绿色荧光蛋白，提供了较强的荧光信号来监测病毒的组装和细胞间的转移。当配合使用的惰性细胞跟踪荧光染料，受体细胞可以从输入供体细胞的歧视，并允许一个可视化的艾滋病毒从被感染的T细胞转移到未受感染的T细胞5的。病毒学突触的形成和病毒从一个细胞转移到另一个，然后可以观察到活细胞，而他们是在一个密封的，透气的成像室培养。 （第一天） 2。艾滋病毒GAG – iGFP转染的Jurkat T细胞的制备通过精心维护2 x 10 5和8 x 10 5细胞/毫升的Jurkat文化传媒（RPMI 1640培养液，10％胎牛血清的浓度细胞的人体的CD4 + T细胞线的Jurkat（ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州） ， 100单位/ mL青霉素和100μg/ mL链霉素）。成功：文化浓度超过8 × 10 5细胞/ ml的Jurkat细胞的关键，将结果在转染效率的降低。 注：转染到T细胞的艾滋病毒GAG – iGFP前病毒DNA，如下所述，在一个复制能力的人类免疫缺陷病毒的生产的结果。因此，所有的程序都只能由受过训练的实验室工作人员进行认证的生物安全水平2 +或三级生物安全水平（BL2 + / BL3）组织培养室。在成像设施艾滋病毒具有传染性的工作必须由当地机构的生物安全办公室批准。 转染质粒的病毒，艾滋病毒使用Amaxa nucleofection方法（龙沙，Walkersville，MD）GAG – iGFP的Jurkats。颗粒5 × 10 6细胞为10分钟，离心150小工吸上清，洗细胞，在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。离心机的细胞和悬浮颗粒97μL预热，nucleofector解决方案包含了制造商的补充V。三年内毒素免费艾滋病毒GAG – iGFP质粒（1微克/μL）μL细胞悬液轻轻混匀。使用程序的S – 18细胞悬液转移到比色皿和nucleofect。立即转移的细胞，以3毫升不含抗生素的培养基预热的Jurkat。 为了准备病毒学突触的CD4 +靶细胞​​，我们取得巴菲大衣的人外周血单核细胞，通过使用标准的聚蔗糖 – 帕确（通用电气医疗集团，瑞典乌普萨拉）协议。 CD4 + T细胞，然后产生负面选择使用磁珠分离试剂盒（美天旎生物技术，赤褐色，CA）。这些可能会在5 × 10 6 cells/500冻结媒体μL（90％胎牛血清serum/10％DMSO）等分液氮低温存储。解冻的主要CD4 + T细胞培养在RPMI 10％胎牛血清辅以10单位/ mL的IL – 2，。 （2天） 3。回收的生活与艾滋病毒GAG – iGFP和靶细胞与荧光染料染色的细胞从Jurkats 允许Jurkat细胞转染在一夜之间恢复。然后取出离心多聚蔗糖hypaque密度梯度材料的细胞碎片。分配1.5毫升的聚蔗糖帕确15 mL锥形管的底部。轻轻覆盖在5 mL体积的RPMI转Jurkats梯度材料。在室温为20分钟关闭制动离心400 XG的细胞。小心取出的细胞用吸管从媒体/聚蔗糖接口。它们转移到一个新的15 mL锥形管。与RMPI稀释的细胞在10分钟的300 XG总量的15毫升和离心机。重悬浮颗粒在2厘米（6孔板）3毫升对Jurkat文化传媒和返回的细胞组织培养的孵化器。 为了区分在细胞与细胞转移实验的供体细胞的靶细胞，我们prelabel的CD4 +与荧光染料的靶细胞。甚至小学CD4 + T细胞被标记ING之前​​使用。 CellTracker和CellTrace染料（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州），我们有优秀的成功标签的T细胞。虽然染料浓度和孵育时间取决于特定的染料和所使用的细胞类型，必须优化，代表协议如下。佩莱4 × 10 6小学的CD4 + T细胞在10分钟的400 XG纺。 5毫升的PBS重悬在2毫升的PBS清洗细胞。添加CellTracker橙（CMTMR，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）至终浓度为1.5微米和孵育在37 ° C加热20分钟。加入8毫升的完整的​​Jurkat媒体和离心机为10分钟400 XG。重悬细胞在3毫升10单位/ mL的IL – 2和在组织培养孵化器放置过夜为辅的完整的媒体。 （3天） 4。监测艾滋病毒的细胞与细胞转移GAG – iGFP使用活细胞成像我们经常使用艾滋病毒GAG – iGFP转染Jurkat细胞转染后48小时。不过，我们已经成功地用作早在24小时细胞，转染后72小时才。 转染后大约48小时，艾滋病毒GAG – iGFP表达Jurkats都计算在内，与CO 洗 2独立媒体（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA），并悬浮在活细胞成像介质（CO 2个独立的媒体，10％胎牛血清， 100 U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素，10个单位/ mL的IL – 2）1-3 × 10 7细胞/ ml的浓度。 以类似的方式，清洗和重新悬浮标记的初级CD4 + T细胞在浓度为1-3 × 10 7细胞/毫升在活细胞成像介质。 混合艾滋病毒GAG – iGFP转Jurkats主要的CD4 + T细胞在一个1:2或1:3的比例和成一个组织处理文化，透气，microchamber（Ibidi，维罗纳，WI）的负载。例如，20μL艾滋病毒GAG – iGFP转Jurkats，40μL标记的初级CD4 + T细胞混合。装入Ibidi室50μL这种混合物和带插头的密封腔。安全包装封口膜插件/ Ibidi室界面的插头。 5。显微镜平台的注意事项：旋转盘共焦成像加载Ibidi成像腔与细胞后，我们立即安装到一个倒置光学显微镜（奥林巴斯IX71，谷中心，PA）的设备。 Ibidi室应转移到显微镜，只能由BL2 +训练有素的实验室人员穿着适当的安全服装。虽然活细胞成像通常使用昂贵的孵化室要保持一个稳定的37 ° C的环境，这是一个简单和经济的恒温加热器（400路ASI，Nevtek，威廉斯维尔，弗吉尼亚州）与T型热电偶尖登上旁边适当的温度反馈的样本。我们发现使用CO 2独立的媒体使我们能够保持高的细胞活力，同时避免使用的 CO 2室。以缓冲对温度波动的平台，并在房间里来阻挡背景室内光线，一个黑色的大导流罩披在整个显微镜/加热器设置，创建一个系统周围的绝缘空气口袋。这大大降低了温度变化和相关的温度相关的样本漂移，但需要预热30分钟前安装样品。 6。数据采集​​，传输和图像处理图片是一个60X 1.42 NA油浸目标（UPlanApo氮，奥林巴斯）使用高数值孔径（NA），大大提高了分辨率。要创建三维共聚焦图像，扫描是由一个旋转盘共聚焦单元（CSU – 10，Yokagawa，日本），同时使用800焦点，大大提高扫描速度。赞扬它的速度，CSU – 10是一个高度敏感的电子倍增电荷耦合器件（EMCCD，IXON + 897，安道尔，爱尔兰）相机，以便快速，低成本的光成像，减少了漂白和光毒性的配对。荧光光源，多波长ArKr离子气体激光器（伊诺70C，连贯，圣克拉拉市）前所需的波长（488纳米）和激光功率测量显微镜物镜（<1毫瓦），是由一个选定声光可调谐滤波器（AOTF），（安道尔）。为了进一步降低漂白和延长总成像时间，AOTF的快速（微秒）关闭激光束每次相机处于非活动状态（10-20毫秒），而新收购的图像从CCD（15-30毫秒暴露）到计算机。激光光耦合到旋转盘系统使用一个405/488/568/647四频分色镜（Semrock，罗切斯特，纽约州）。荧光发射过滤内使用一个过滤器轮（Ludl电子产品，霍桑，NY）一个50分之525的带通滤波器（Semrock）装between EMCCD相机和共聚焦旋转盘单位。所有的硬件​​和收购，包括Z -阶段（疯狂的城市实验室，麦迪逊，威斯康星州），安道尔IQ V1.8软件控制。为了最大限度地提高采集速度约为1.2-1.9秒的三维图像栈，我们作物的EMCCD的相机记录区域细胞对邻近地区。此外，在牺牲在Z的一些信息，0.45-0.75微米之间的一个大Z -步可用于加快收购。在这些条件下的成像可以持续长达6个小时 – 使用连续20-60分钟的环节 – 以最小的漂白。总之，每个数据段通常占5-20 GB的空间，是数以万计的图像。为了便于运输和分析大量的数据文件，每次采集设置需要被分解和1 ​​GB TIFF图像文件段使用安道尔IQ V1.8软件出口。从这里，许多优秀的软件程序包可用于图像的分析，如Metamorph，Volocity和ImageJ（我们建议其变化斐济），。 当两个荧光标记被跟踪，我们同时记录他们都没有放慢收购使用“画面分割模式。”由两个不同的ArKr一次激光线（通常为488和568纳米）两项指标很高兴。直接插入前EMCCD相机是分隔两个不同的图像，图像的分离器（OptoSplit二，山，肯特，英国）。每幅图像，然后独立使用相机上曾经创造了“分屏”效应的荧光过滤器（Semrock）和预计端侧的过滤。这将需要人工裁剪和调整后的图像在图像处理。 7。图像处理和数据分析的注意事项我们通常执行与图像分析Volocity（珀金埃尔默，马萨诸塞州沃尔瑟姆，在Macintosh计算机上）（苹果公司）。旋转盘激光共聚焦显微镜图像先调整正确Volocity deconvolved然后漂白，在它们的强度。加格puncta强度测量和跟踪执行Volocity定量模块。对于预先形成的突触相对运动需要计算的图像集，采用自动跟踪​​算法跟踪整个序列的突触按钮。由自动跟踪软件定义的利息地区的人工检验，必须执行，以确认该软件已经正确地跟踪期望的对象。手动跟踪对象与周围物体的对比度太弱，可能是一帧帧的基础上进行。 Volocity软件包允许出口X​​YZ的位置，数量和范围内所需的对象集成的信号。正常化运动突触按钮的中心，突触和速度的跟踪对象的距离计算。 8。代表性的成果在10至15分钟，搅拌，应该能够看到艾滋病毒GAG – iGFP表达Jurkat细胞坚持初级CD4 + T细胞。成像这些结合物，可以评估在受感染的细胞，以及在靶细胞后synaspe加格puncta变动。人们可以观察到靶细胞的GAG – iGFP puncta运动后不久，突触形成。

Discussion

我们在这里介绍一个简单的方法，以可视化的艾滋病毒细胞与细胞间的转移。从我们的实验室和其他人最近的研究表明，这可能是T细胞之间传播艾滋病毒的主要模式。这里介绍的方法采用了艾滋病毒的重组形式，被称为艾滋病毒GAG – iGFP，它带有一种基因编码的绿色荧光蛋白标记为核心的结构蛋白，GAG的。由于每个病毒粒子产生的绿色荧光蛋白的水平高，这对艾滋病毒的复制能力的克隆使研究人员能够实时跟踪单个病毒颗粒。关于艾滋病毒的组装和细胞与细胞转移的研究，这种病毒应该特别有用。

艾滋病毒的细胞与细胞转移的转移，是高效的。在三个小时的合作文化，我们日常看到病毒转移到20-30％的原发性T细胞流式细胞仪评估。在活细胞成像定性看到类似的效率。开始后几乎立即开始联合培养的T细胞与未感染的主要病毒感染的T细胞形成突触。有趣的，并非所有的主要的T细胞相互作用与激光镊子（未发表意见，GM）被迫与艾滋病毒感染的Jurkat细胞相互作用，尽管的能力。确定T细胞亚群细胞-细胞在体外和体内的转移，是最容易受到艾滋病毒GAG – iGFP无疑将是有益的。

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Jurkat T Cells		ATCC
Leukocyte buffy coats from whole blood		New York Blood Center
RPMI		Sigma
Fetal Bovine Serum		Hyclone
Penicillin/Streptomycin		Invitrogen
Nucleofector System and Solution V		Lonza
EndoFree Maxi Prep Kits		Qiagen
HIV Gag-iGFP plasmid		Chen Laboratory
CD4+ T Cell Isolation Kit		Miltenyi Biotec
Ficoll-Paque		GE Healthcare
Celltracker/CellTrace Dyes		Invitrogen
CO2-Independent Media		Invitrogen
Imaging Chambers		Ibidi
Olympus IX-71 Inverted Microscope		Olympus
PlanApo N 1.42NA 60X oil objective		Olympus
Innova 70C ArKr ion gas laser		Coherent
CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit		Yokogawa
Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter		Semrock
525/50 bandpass filter		Semrock
iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera		Andor
ASI 400 Thermostatic Heater		Nevtek