La quantificazione di DNA a doppio filamento sulla base di γH2AX focolai è diventato uno strumento prezioso, in particolare in biologia radiazione, per la valutazione della radiosensibilità dei tessuti e gli effetti dei composti radiazione modificando. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione del γH2AX focolai in campioni di tessuto.
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Articolo metodologico
ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto
In questo articolo
Sommario
Abstract
DNA a doppio filamento (DSB) sono lesioni particolarmente letali e genotossici, che possono derivare sia da processi endogeni (fisiologici o patologici) o da fattori esogeni, in particolare le radiazioni ionizzanti e composti radiomimetici. Fosforilazione della variante dell'istone H2A, H2AX, alla serina-139 residui, altamente conservati nel C-terminale motivo SQEY, formando γH2AX, è una risposta precoce al DNA a doppio filamento
Protocollo
Tessuti
- Tessuto polmonare, incorporati in stampi in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto 4583, è stato sezionato (5 micron) utilizzando un criostato Leica CM 1950, montato su poli-L-lisina diapositive.
I campioni congelati sono stati ottenuti dal dottor Simon Royce a bambini di Murdoch Research Institute. Tessuto polmonare è stato ottenuto da Balb non trattata / c topi e da un modello murino della malattia allergica cronica delle vie aeree che mostra molte delle caratteristiche patologiche di asma umano 6. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti ....
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Discussione
Ai fini di questa dimostrazione abbiamo usato tessuto polmonare del mouse non trattati da Balb / c topi e da un modello murino della malattia allergica cronica delle vie aeree. Abbiamo quantificato differenze nel numero di focolai per cella con medie leggermente più alto osservato nei polmoni danneggiati rispetto a sezioni non trattati. In particolare, la quantificazione indicato per 6,5 focolai / cellulare e del 9,4 per focolai / cella (conteggio manuale di 20 cellule per sezione), nei tessuti non trattati e cronica ma.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM è supportato da Melbourne di ricerca (Università di Melbourne) e borse di studio integrative Biomedical Imaging CRC. Il supporto di Monash Micro Imaging (Dr. Stephen Cody e Iska Carmichael) è stata preziosa per questo lavoro. MMT è grata per l'assistenza di esperti e la consulenza del Dr. Olga Sedelnikova dal National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | L'BSA (1%) viene utilizzato per bloccare qualsiasi legame non specifico degli anticorpi. Gli anticorpi primari e secondari vengono diluiti in BSA. | |
| PBS (senza Ca)2+ e Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Composto OCT (Optimal Cutting Temperature) 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Vetrini Polysine | Menzel-Glaser | SF41296SP | Attrae elettrostaticamente sezioni di tessuto congelato e riduce la necessità di rivestimenti e adesivi aggiuntivi. |
| Tween 20 | Reagente | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0,5%) è un detergente utilizzato per permeabilizzare le cellule |
| Triton X-100 | Reagente | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0,1%) utilizzato per permeabilizzare le cellule. |
| Paraformaldeide | Reagente | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-fosfo-γH2AX (anticorpo policlonale da coniglio) | Anticorpo primario | Upstate, Millipore | 07-164 | Diluizione dell'anticorpo primario (1:500) in BSA al 1%. |
| Alexa Fluor 488 anticorpo caprino anti-coniglio IgG (H+L) | Anticorpo secondario | Invitrogen | A-11008 | Diluizione dell'anticorpo secondario (1:500) in BSA al 1%. |
| Etanolo (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagente | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagente | Vector Laboratories | H-1300 | Un mezzo di montaggio a base di glicerolo contenente ioduro di propidio (un colorante nucleare rosso). Questo mezzo deve essere utilizzato con un obiettivo a immersione in olio che corrisponda al suo indice di rifrazione. Nota: colorante per DNA comunemente utilizzato: 4,6-diamidino-2-fenilindolo diidrocloruro (DAPI). Può essere utilizzato solo con microscopi dotati del laser di eccitazione appropriato. |
| Mini penna PAP | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslip (22x50 mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Vaso Coplin, in vetro | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Vasca di colorazione | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocale | Microscopio confocale | |||
| CM Leica 1950 Criostato | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software per l'analisi delle immagini | Molecular Devices |
Riferimenti
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S.
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Ristampe e permessi
