Label-free In situ Imaging van Lignification in Plant celwanden
Summary
Een methode gebaseerd op confocale Raman microscopie wordt gepresenteerd die biedt label-free visualisatie van lignine in plantaardige celwanden en vergelijking van lignification in verschillende weefsels, monsters of soort.
Abstract
Aan de groeiende vraag naar energie veilig en efficiënt is een urgente mondiale uitdaging. Daarom heeft het onderzoek naar de productie van biobrandstoffen, dat wordt gezocht naar kosteneffectieve en duurzame oplossingen uitgegroeid tot een actueel en kritische taak. Lignocellulose biomassa is klaar om de primaire bron van biomassa voor de conversie naar vloeibare biobrandstoffen 1-6 geworden. Echter, de weerspannigheid van deze plant celwand materialen om kosten-effectieve en efficiënte degradatie vormt een grote belemmering voor het gebruik ervan bij de productie van biobrandstoffen en chemicaliën 4. In het bijzonder, lignine, een complex en onregelmatige poly-phenylpropanoid heteropolymeer, wordt problematisch om de na-oogst deconstructie van lignocellulose biomassa. Bijvoorbeeld in biomassa conversie voor biobrandstoffen, het remt versuikering in processen gericht op het produceren van eenvoudige suikers voor vergisting 7. Het effectieve gebruik van plantaardige biomassa voor industriële doeleinden is in feite grotendeels afhankelijk van de mate waarin de plant celwand is lignified. Het verwijderen van lignine is een kostbare en beperkende factor 8 en lignine is derhalve een sleutelelement het kweken van planten en genetische manipulatie doel om celwand conversie te verbeteren.
Analytische instrumenten die de accurate snelle karakterisering van lignification van plantaardige celwanden vergunning steeds belangrijker geworden voor het beoordelen van een groot aantal broedpopulaties. Extractieve procedures voor de isolatie van inheemse componenten zoals lignine zijn onvermijdelijk destructief, waardoor over belangrijke chemische en structurele wijzigingen 9-11. Analytisch chemische in-situ methoden zijn dus van onschatbare waarde tools voor de samenstelling en structurele karakterisatie van lignocellulose materialen. Raman microscopie is een techniek die is gebaseerd op inelastische of Raman verstrooiing van monochromatisch licht, net als dat van een laser, waarbij de verschuiving in energie van de laser fotonen is gerelateerd aan de moleculaire vibraties en presenteert een intrinsieke label-free moleculaire "vingerafdruk" van het monster . Raman microscopie kan het zich veroorloven niet-destructieve en relatief goedkope metingen met een minimale monstervoorbereiding, het geven van inzicht in chemische samenstelling en de moleculaire structuur in een dicht bij de oorspronkelijke toestand. Chemische beeldvorming door confocale Raman microscopie is al eerder gebruikt voor de visualisatie van de ruimtelijke verdeling van cellulose en lignine in het hout celwanden 12-14. Op basis van deze eerdere resultaten, hebben wij onlangs deze methode om lignification vergelijken in wild-type en lignine-deficiënte transgene Populus trichocarpa (zwart Cottonwood) steel hout 15. Het analyseren van de lignine Raman bands 16,17 in het spectrale gebied tussen 1600 en 1700 cm -1, lignine signaal intensiteit en lokalisatie in kaart gebracht in situ. Onze aanpak gevisualiseerd verschillen in de lignine-gehalte, lokalisatie, en chemische samenstelling. Recentelijk hebben we aangetoond Raman beeldvorming van de celwand polymeren in Arabidopsis thaliana met een laterale resolutie die is sub-um 18. Hier wordt deze methode gepresenteerd bieden visualisatie van lignine in plantaardige celwanden en vergelijking van lignification in verschillende weefsels, monsters of species zonder vlekken of de etikettering van de weefsels.
Protocol
Discussion
Lignocellulose materialen zijn hiërarchisch en heterogeen met betrekking tot zowel de structuur en samenstelling. Voor een diepgaande karakterisering analytische hulpmiddelen die chemische overgevoeligheid, ruimtelijke resolutie, en die inzicht geven in deze materialen in de inheemse context wenselijk zijn. De beschreven werkwijze biedt de visualisatie van lignine en vergelijking van lignification van lignocellulose plantaardige biomassa met ruimtelijke resolutie die is sub-micrometer, zonder vlekken of de etikettering…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Andrew Carroll, Bright Chaibang, Purbasha Sarkar (Energy Biosciences Institute, Berkeley), Bahram Parvin (Lawrence Berkeley National Laboratory) en Vincent L. Chiang (North Carolina State University) voor de vruchtbare samenwerking en nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door het Energy Biosciences Institute. Werken bij de Moleculaire Foundry werd gesteund door de Office of Science, Bureau van Basic Energy Sciences, van het Amerikaanse ministerie van Energie onder contract nummer DE-AC02-05CH1123.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| microscope slides | ||||
| cover slips | ||||
| D2O | ||||
| nail polish | ||||
| immersion oil | ||||
| tweezers | ||||
| pointed brush | ||||
| microtome | ||||
| confocal Raman microscope |
Riferimenti
- Herrera, S. Bonkers about biofuels. Nat Biotechnol. 24, 755-760 (2006).
- Himmel, M. E. Biomass recalcitrance: Engineering plants and enzymes for biofuels production. Science. 315, 804-807 (2007).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54, 559-568 (2008).
- Pauly, M., Keegstra, K. Physiology and metabolism ‘Tear down this wall. Curr Opin Plant Biol. 11, 233-235 (2008).
- Ragauskas, A. J. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311, 484-489 (2006).
- Somerville, C. Biofuels. Curr Biol. 17, R115-R119 (2007).
- Ralph, J., Brunow, G., Boerjan, W. . Lignins in Encyclopedia of Life Sciences. , (2007).
- Chiang, V. L. From rags to riches. Nat Biotechnol. 20, 557-558 (2002).
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Raman microprobe evidence for lignin orientation in the cell walls of native woody tissue. Science. 227, 636-638 (1985).
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Recording Raman spectra from plant cell walls. J Raman Spectrosc. 17, 229-231 (1986).
- Fukushima, K. Regulation of syringyl to guaiacyl ratio in lignin biosynthesis. J Plant Res. 114, 499-508 (2001).
- Agarwal, U. P. Raman imaging to investigate ultrastructure and composition of plant cell walls: distribution of lignin and cellulose in black spruce wood (Picea mariana). Planta. 224, 1141-1153 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. Chemical imaging of poplar wood cell walls by confocal Raman microscopy. Plant Physiol. 140, 1246-1254 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. The potential of Raman microscopy and Raman imaging in plant research. Spectrosc Int J. 21, 69-89 (2007).
- Schmidt, M. Label-free in situ imaging of lignification in the cell wall of low lignin transgenic Populus trichocarpa. Planta. 230, 589-597 (2009).
- Agarwal, U. P., Argyropoulos, D. S. An Overview of Raman Spectroscopy as Applied to Lignocellulosic Materials. Advances in Lignocellulosics Characterization. , 201-225 (1999).
- Agarwal, U. P., Ralph, S. A. Determination of ethylenic residues in wood and TMP of spruce by FT-Raman spectroscopy. Holzforschung. 62, 667-675 (2008).
- Schmidt, M. Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana. Biochem Biophys Res Comm. 395, 521-523 (2010).
