Label-free På plats Avbildning av Lignification i växternas cellväggar
Summary
En metod baserad på konfokala Raman mikroskopi presenteras som ger etiketten utan visualisering av lignin i växternas cellväggar och jämförelse av lignification i olika vävnader, prover eller arter.
Abstract
Möte växande energibehov på ett säkert och effektivt sätt finns ett trängande global utmaning. Därför har forskning kring produktion av biobränslen som syftar till att hitta kostnadseffektiva och hållbara lösningar blir en aktuell och viktig uppgift. Lignocellulosa är redo att bli den främsta källan till biomassa för konvertering till flytande biobränslen 1-6. Däremot presenterar motspänstighet av dessa vägg växtcell material till kostnadseffektiv och effektiv nedbrytning ett stort hinder för deras användning i produktionen av biobränslen och kemikalier 4. Framför allt blir lignin, en komplex och oregelbunden poly-phenylpropanoid heteropolymer, problematiskt att de postharvest dekonstruktion av lignocellulosa. Till exempel i biomassa konvertering till biobränsle, hämmar det försockringen i processer som syftar till att producera enkla sockerarter för jäsning 7. En effektiv användning av växt-biomassa för industriella ändamål är i själva verket stor del beroende av i vilken omfattning anläggningen cellväggen är förvedade. Borttagandet av lignin är en dyr och begränsande faktor 8 och lignin har därför blivit en viktig växtförädling och genteknik mål för att förbättra konverteringen cellvägg.
Analytiska verktyg som möjliggör noggrann snabb karaktärisering av lignification av växternas cellväggar blivit allt viktigare för att utvärdera ett stort antal häckande populationer. Extraktiva förfaranden för isolering av infödda komponenter såsom lignin oundvikligen destruktiva, åstadkomma betydande kemiska och strukturella förändringar 9-11. Analytisk kemiska in situ metoder är därför ovärderliga verktyg för sammansättning och strukturella karakterisering av lignocellulosa. Raman mikroskopi är en teknik som bygger på oelastisk eller Ramanspridning av monokromatiskt ljus, som det från en laser, där övergången i energi av laser fotoner är relaterat till molekylära vibrationer och presenterar en inneboende etikett-fri molekylära "fingeravtryck" av provet . Ramanmikroskopi råd med icke-förstörande och förhållandevis billiga mätningar med minimal provberedning och ger insikter i kemiska sammansättning och molekylära struktur i en nära infödd stat. Kemisk avbildning av konfokala Raman mikroskopi har använts tidigare för visualisering av den rumsliga fördelningen av cellulosa och lignin i väggar av trä cell 12-14. Baserat på dessa tidigare resultat, har vi nyligen antagit denna metod för att jämföra lignification i vildtyp och lignin-brist transgena Populus trichocarpa (svart bomullsträd) stamved 15. Analysera lignin Raman banden 16,17 i den spektrala regionen mellan 1600 och 1700 cm -1, lignin signal intensitet och lokalisering kartlades på plats. Vår strategi visualiseras skillnader i lignin innehåll, lokalisering och kemiska sammansättning. Senast visade vi Raman avbildning av polymerer cellvägg i Arabidopsis thaliana med lateral upplösning som är sub-ìm 18. Här presenteras denna metod som ger visualisering av lignin i växternas cellväggar och jämförelse av lignification i olika vävnader, prover eller arter utan färgning eller märkning av vävnader.
Protocol
Discussion
Lignocellulosa är hierarkiska och heterogena både vad gäller struktur och sammansättning. För en fördjupad beskrivning analysverktyg som har kemisk känslighet, rumslig upplösning, och att ge insikter i dessa material i det ursprungliga sammanhanget är önskvärda. Den beskrivna metoden ger visualisering av lignin och jämförelse av lignification av lignocellulosa växtbiomassa med rumslig upplösning som är sub-ìm utan färgning eller märkning av proverna i en nära infödd stat. Det kräver minimal provber…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Andrew Carroll, Bright Chaibang, Purbasha Sarkar (energi biovetenskaper Institute, Berkeley), Bahram Parvin (Lawrence Berkeley National Laboratory) och Vincent L. Chiang (North Carolina State University) för givande samarbeten och hjälpsamma diskussioner. Detta arbete stöddes av energi biovetenskaper Institute. Arbeta på molekylär Gjuteri stöddes av Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, av US Department of Energy i Kontrakt nr DE-AC02-05CH1123.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| microscope slides | ||||
| cover slips | ||||
| D2O | ||||
| nail polish | ||||
| immersion oil | ||||
| tweezers | ||||
| pointed brush | ||||
| microtome | ||||
| confocal Raman microscope |
Riferimenti
- Herrera, S. Bonkers about biofuels. Nat Biotechnol. 24, 755-760 (2006).
- Himmel, M. E. Biomass recalcitrance: Engineering plants and enzymes for biofuels production. Science. 315, 804-807 (2007).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54, 559-568 (2008).
- Pauly, M., Keegstra, K. Physiology and metabolism ‘Tear down this wall. Curr Opin Plant Biol. 11, 233-235 (2008).
- Ragauskas, A. J. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311, 484-489 (2006).
- Somerville, C. Biofuels. Curr Biol. 17, R115-R119 (2007).
- Ralph, J., Brunow, G., Boerjan, W. . Lignins in Encyclopedia of Life Sciences. , (2007).
- Chiang, V. L. From rags to riches. Nat Biotechnol. 20, 557-558 (2002).
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Raman microprobe evidence for lignin orientation in the cell walls of native woody tissue. Science. 227, 636-638 (1985).
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Recording Raman spectra from plant cell walls. J Raman Spectrosc. 17, 229-231 (1986).
- Fukushima, K. Regulation of syringyl to guaiacyl ratio in lignin biosynthesis. J Plant Res. 114, 499-508 (2001).
- Agarwal, U. P. Raman imaging to investigate ultrastructure and composition of plant cell walls: distribution of lignin and cellulose in black spruce wood (Picea mariana). Planta. 224, 1141-1153 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. Chemical imaging of poplar wood cell walls by confocal Raman microscopy. Plant Physiol. 140, 1246-1254 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. The potential of Raman microscopy and Raman imaging in plant research. Spectrosc Int J. 21, 69-89 (2007).
- Schmidt, M. Label-free in situ imaging of lignification in the cell wall of low lignin transgenic Populus trichocarpa. Planta. 230, 589-597 (2009).
- Agarwal, U. P., Argyropoulos, D. S. An Overview of Raman Spectroscopy as Applied to Lignocellulosic Materials. Advances in Lignocellulosics Characterization. , 201-225 (1999).
- Agarwal, U. P., Ralph, S. A. Determination of ethylenic residues in wood and TMP of spruce by FT-Raman spectroscopy. Holzforschung. 62, 667-675 (2008).
- Schmidt, M. Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana. Biochem Biophys Res Comm. 395, 521-523 (2010).
