IP FCM的方法是,允许一个敏感的,健壮的,原生的蛋白质 – 蛋白质相互作用的生化评估,而无需遗传工程或大样本。
通过流式细胞仪检测免疫沉淀(IP,FCM)是一种用于检测和定量蛋白质相互作用的有效方法。基本原则延伸夹心ELISA法,其中捕获的主要分析物可以检测到身体内多蛋白复合物相关的其他分子一起。该过程涉及与immunoprecipitating单克隆抗体(mAb)的具体利益的蛋白质,细胞裂解液中培育这些珠子,捕获的蛋白复合物与荧光标记的探针探测,并通过流式细胞仪分析珠相关的荧光聚苯乙烯乳胶微球的共价偶联。 IP – FCM是极其敏感的,允许在本机(非变性)状态的蛋白质分析,并服从或者半定量或定量分析。 IP – FCM需要作为额外的好处,没有基因工程或专门的设备,流式细胞仪以外,它可以很容易地适应高通量应用。
有关蛋白质相互作用的信息是高度相关的许多细胞过程,如信号转导,谱系成熟,细胞周期的进展,和凋亡级联的分析。 IP – FCM提供了快速,定量和敏感的方法,研究蛋白质的相互作用,并定义多蛋白复合物的成员在他们的天然构象。珠可以加上和培养细胞裂解液在一天之内,可以探测和分析第二天。一个96孔板格式允许对大量样品分析的数字,在同一时间提供高效的数据收集统计或筛选的目的。使用荧光珠标准,每个珠子捕获的蛋白质的数量可以估算的。源材料是很少需要捕捉和检测,使有限的样品和稀缺的分析物仍然可以为多个交互分析。虽然不需要IP – FCM的基因工程技术,抗原表位标记,变性,或在体外混合蛋白在非生理性的环境,它可以加上这些和其他技术,使得它与适用性的宝贵和访问工具许多生物系统。
故障排除:
许多IP – FCM的实验产生有用的蛋白质相互作用数据,他们首次尝试。然而,IP – FCM的优化可以提高抗体共轭珠,蛋白质复合体捕获,荧光探针结合。
可通过直接探测反免疫球蛋白抗体偶联珠IP抗体共轭的效率。如果效率低,增加在偶联反应的抗体浓度,可以让更多的IP抗体附加到每个珠子。这可以提高IP珠一批具有约束力的能力,增强型捕捉和分析物的检测。其他主要的胺(如三,牛血清白蛋白),其中包含分子不应该存在的偶联反应过程中,因为这些都可以与单克隆抗体的竞争珠附着在单克隆抗体低耦合的结果。如果共轭珠单抗证明问题等原因,珠,而不是可以被耦合到亲和素/链霉亲,生物素化抗体可以随后非共价键结合和immunprecipitation使用。
尽管良好的抗体共轭,初步检测珠相关的荧光可能偏低。第一,复杂的捕捉本身可能是低的。由于IP – FCM取决于分析物的浓度,增加单位的溶解量裂解细胞的数量,可提高分析物的捕获和检测。此外,捕捉可能是通过减少孵育裂解液,分配捕获复合物横跨珠少,增加每珠平均荧光探测的结果IP珠增强。其次,它是可能的探头抗体捕获复合物的访问是立体immunoprecipitating抗体阻碍。在这种情况下,问题可以得到解决,使用不同的抗体捕获和/或探针。
这项工作是由老鹰创新奖(联谊订购老鹰)和由梅奥基金会的支持。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics Corporation/Molecular Probes | 2-5000 | Store at 4°C. |
Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma | M-5287 | |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Pierce Sigma |
22980 E-6383 |
Store at -20°C under desiccating conditions. |
Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |