يعيش استجابة الخلية لتحفيز الميكانيكية المتكاملة التي درستها فرقة الميكروسكوب الضوئي والذرية
Summary
هذه الورقة تهدف إلى إرشاد القارئ في عملية متكاملة لقوة ذرية المجهر البصرية التصوير الميكانيكي لتحفيز الخلايا الحية في الثقافة. ويرد بروتوكول خطوة بخطوة. وقدم ممثل مجموعة البيانات التي تظهر استجابة الخلية الحية لتحفيز الميكانيكية.
Abstract
لفهم الآلية التي الخلايا الحية الشعور القوات الميكانيكية ، وكيف تستجيب وتتكيف مع بيئتها ، وهي تكنولوجيا جديدة قادرة على التحقيق في سلوك الخلايا الفرعية الخلوية عالية المستوى مع القرار المكانية والزمانية والمتقدمة. وهكذا ، تم دمج مجهر القوة الذرية (AFM) مع مجموع المجهري التأمل الداخلي (TIRF) مضان والقرص التي تدور بسرعة (FSD) المجهري متحد البؤر. منظومة متكاملة قابلة للتطبيق على نطاق واسع عبر طائفة واسعة من الدراسات الحيوية الجزيئية في الخلايا الحية أي ملتصقة ، مما يسمح التصوير الضوئي المباشر للاستجابات الخلايا لتحفيز الميكانيكية في الوقت الحقيقي. وقد أظهرت إعادة ترتيب كبيرة من شعيرات أكتين والالتصاقات البؤرية بسبب تحفيز الميكانيكية المحلية على سطح الخلية التي يسببها قمية تغييرات في الهيكل الخلوي في جميع أنحاء الجسم الخلية. وهذه التقنيات المبتكرة لتوفير معلومات جديدة فهم يعيشون إعادة هيكلة الخلية واستجابة لديناميات القوة الميكانيكية. بروتوكول بيانات مفصلة وممثل المجموعة التي ترد ردا تظهر الخلية الحية لتحفيز الميكانيكية.
Protocol
Discussion
التصاقات الهيكل الخلوي 70-10 11-16 والتنسيق والهياكل الديناميكية التي تجميع وتفريق وتسليم وترحيل الخلايا أو الاستجابة لقوة ميكانيكية 17. لديهم وظائف كبيرة في تنظيم نمو الخلايا ، وبقاء ، والتعبير الجيني. معرفة التوزيع الخاصة بها وديناميكية توفر فهما أفضل لكيف…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان Vinculin – GFP البلازميد هدية من يامادا كينيث والمعاهد الوطنية للصحة ، المعهد الوطني للأبحاث الأسنان والجمجمة ، بيثيسدا بولاية ميريلاند ، وأكتين mRFP – البلازميد كان هدية من مايكل ديفيدسون ، جامعة ولاية فلوريدا ، تالاهاسي (فلوريدا).
وأيد هذا العمل من قبل الجائزة شهادة NSF # 0747334 وAHA الجنسيات SDG # 0835205N لأندريا Trache.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AFM tip | Novascan Technologies | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | ||
| avidin | Sigma Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F4759 | 1 mg/mL | |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | ||
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza | VPI-1004 | ||
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corporation | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
Riferimenti
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A., Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , 2.1-2.17 (2008).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
- Trache, A., Meininger, G. A., Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , 2.1-2.22 (2008).
- Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
- Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
- Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
- Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
- Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
- Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
- Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
- Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
- Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).
