في البروتوكول الموقع للأجنحة الفراشة العذراء طريق Riboprobes
Summary
من أجل دراسة التعبير الجيني في أنسجة الجناح العذراء من anynana Bicyclus ، نقدم بروتوكول الأمثل لفي الموقع التهجين باستخدام riboprobes. كما نقوم بتوفير مبادئ توجيهية لمزيد من التحسين على هذا البروتوكول لاستخدامها في أجنحة العذراء الأنواع Lepidopteran الأخرى.
Abstract
هنا نقدم ، في شكل شرائط فيديو ، وبروتوكول لالتهجين في الموقع في أجنحة العذراء من anynana Bicyclus فراشة riboprobes به. التهجين في الموقع ، وهي الدعامة الأساسية لعلم الأحياء التطوري ومفيدة لدراسة الأنماط المكانية والزمانية في التعبير الجيني في أنسجة النامية على مستوى النسخ. إذا الأجسام المضادة التي تستهدف منتجات البروتين من النسخ الجيني لم يتم تطويرها ، و / أو وجود نسخ متعددة من الجينات بروتين معين في الخريطة الوراثية البشرية التي لا يمكن أن تكون متباينة باستخدام الاجسام المضادة المتوفرة ، يمكن أن تستخدم في مكان المال بدلا من ذلك. في حين أن الوضع الطبيعي للتقنية أقراص الجناح اليرقات كانت متاحة للمجتمع فراشة لعدة سنوات ، وقد تم تحسين البروتوكول الحالي لأجنحة العذراء أكبر وأكثر هشاشة.
Protocol
Discussion
تعظيم الاستفادة من البروتوكولات القائمة
التهجين في الموقع على أقراص الجناح اليرقات أجريت بنجاح باستخدام أقراص من الفراشات coenia نبذة (كارول وآخرون 1994 ؛. كيز وآخرون 1999 ؛. Weatherbee وآخرون 1999). وقد تم تكييف البروتوكول الحالي من بروتوكول الخطية المفصلة متوفرة ع…
Acknowledgements
نشكر جين Selegue ، هولينجسورث مارغريت ، بيري جين ، Futahashi ريو ، Najmus محفوظ سحر Popadic الكسندر بوب ريد ، روش الدعم الفني للحصول على مساعدة في استكشاف هذا البروتوكول. ونحن نشكر أيضا وليم Piel للحصول على المشورة حول تحرير الفيلم.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5g/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Applied Science | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Applied Science | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma | C0612 | Mounting Medium |
Riferimenti
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
