Al fine di esaminare l'espressione genica nel tessuto ala pupa di Bicyclus anynana, presentiamo un protocollo ottimizzato per ibridazioni in situ utilizzando riboprobes. Forniamo anche linee guida per l'ottimizzazione di questo protocollo per l'utilizzo in ali pupa di altre specie di lepidotteri.
Abstract
Qui vi presentiamo, in formato video, un protocollo per ibridazioni in situ in pupa ali della farfalla Bicyclus anynana utilizzando riboprobes. In ibridazioni in situ, un pilastro della biologia dello sviluppo, sono utili per studiare i modelli spaziali e temporali di espressione genica nello sviluppo di tessuti a livello della trascrizione. Se gli anticorpi che colpiscono i prodotti proteici di trascrizione del gene non sono ancora stati sviluppati, e / o ci sono copie del gene multiple di una particolare proteina del genoma che non possono essere differenziate utilizzando anticorpi disponibili, in situs può essere utilizzato in sostituzione. Mentre un a tecnica in situ per dischi ala larvale è stato a disposizione della comunità farfalla per diversi anni, l'attuale protocollo è stato ottimizzato per le ali più grandi e più fragile pupa.
Protocol
GIORNO 1 Preparare le seguenti soluzioni: 10x PBS 1x PBS 1x PBT DDH 2 O Aggiungi DEPC per lo 0,1% del volume totale e scuotere vigorosamente le soluzioni. Autoclave. Fix paraformaldeide 4% – con PBS-DEPC Soluzione di proteinasi K – presenza di un precipitato, vortice vigorosamente prima di rimuovere aliquota Digestione di arresto Buffer Prehybridization Buffer 50:50 PBT: Buffer Preh…
Discussion
Ottimizzazione dei protocolli esistenti
In ibridazioni in situ su dischi ala larvali sono stati effettuati con successo con i dischi da Précis farfalle coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. L'attuale protocollo è stato adattato da un protocollo dettagliato scritto disponibili su richiesta presso il Laboratorio Carroll colorazioni ala larvale. I cambiamenti che abbiamo fatto servono ad accogliere le differenze tra i tessuti ala larvale e pupale. Durante la pupa dissezioni hindwing, la membrana …
Acknowledgements
Ringraziamo Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche supporto tecnico per assistenza per la risoluzione di questo protocollo. Ringraziamo anche William Piel per consigli su come modificare il film.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Fix Buffer
4% Paraformaldehyde in PBS
PBT
0.1% Tween 20 in PBS
Proteinase K solution
2.5g/ml Proteinase K in PBT
Digestion Stop Buffer
2 mg/ml glycine in PBT
Pre-Hybridization Buffer
For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution).
Hybridization Buffer
Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer
Block Buffer
50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA