我们展示了基因枪的使用,引入神经元在不同年龄段的啮齿类动物和非人类灵长类动物的大脑切片的荧光染料,如直接投资收益,。在这种特殊情况下,我们使用成年小鼠(3-6个月以上)和成人cynomologus猴子(9-15岁)。这项技术,最初是由实验室博士李奇曼(甘<em>等</em>,2000年),是非常适合的分支的树突和树突棘形态的研究,可与传统的免疫相结合,如果保持在低浓度的洗涤剂。
DiOLISTIC染色采用基因枪,引入神经 元脑片(甘等人,2009年; O'Brien和Lummis,2007年,甘等,2000)。荧光染料,如直接投资收益,。在这里,我们提供了一个好的和坏的结果,这将有助于设立的技术,当模范的图像所需的每一步的详细说明。根据我们的经验,几步证明的成功应用DiOLISTICS的关键。这些考虑因素包括DII涂层子弹的质量,固定液暴露程度,和孵化解决方案中使用的洗涤剂浓度。提供提示和常见问题的解决。
这是一个多功能的标签技术,可以适用于广泛的年龄多种动物物种。 DiOLISTIC标签,准备从年轻的动物或限制,因为他们依靠一个荧光的转基因表达对小鼠与其他荧光标记技术,可以适用于所有年龄段,物种和基因型的动物,它可以结合使用免疫识别特定的细胞亚群。在这里,我们展示了使用标签神经元的DiOLISTICS量化枝蔓分支和树突棘形态的目的从成年小鼠和成人的非人类灵长类动物的大脑切片。
DiOLISTIC标签是最通用的技术可用于细胞荧光标签之一,因为它可以从不同的物种的组织切片,广泛的年龄,和组织获得新鲜或从固定液灌注动物(见也甘等,2009)。这个过程是比较快的,因为它需要1-2天,它可以与其他更经典的标签的方法,如免疫(Lee 等 ,2006)相结合。特别应重视避免过度固定和孵化解决方案使用高洗涤剂浓度,因为这些将包括的亲脂膜的完整性,并导致染料泄漏的细胞。低浓度促进抗体的渗透可以通过TRITON X – 100(Lee 等 ,2006),以及毛地黄皂苷或皂苷洗液(松林等,2008)。这种技术可以应用到的一些修改,包括与甘等人(2000)或改变抗体曝光( 尼利等,2009)的长度和类型的多个染料使用的子弹。
传统上,DII已经用于跟踪在大脑中的神经元的预测。 DiOLISTIC标签扩展描述一个有用的方法来研究细胞的形态及其应用。极大的兴趣,因为在大脑中发现的大型多样性和猜测,细胞的形状可能反映在中枢神经系统的神经元群体的功能多重的神经元的形态。这样的一个例子是,事实上,在许多哺乳动物的中枢神经系统显示的小突起神经元称为树突棘是谷氨酸突触的网站。通过这种方式,可以到一个细胞的谷氨酸突触的密度相关的树突棘密度,使用此处所述的标记技术,可以测量。此外,如树突总长度,分枝格局,树突棘的形状和密度等形态参数可量化和研究。
使用荧光标记,为研究神经元的形态有许多优点相比,更多的传统技术依赖亮视野显微镜(如高尔基染色),因为它允许更高的分辨率共焦成像。使用DII作为一个旨在测量树突棘密度的实验中的荧光团和形态的另一个优点是其亲脂性的属性。 DII到质膜分区,并提供一个明确界定的神经元突起和树突状突起的轮廓。鉴于大多数树突棘(小于1 femtoliter)体积小,染色膜是更有效的,并允许更好的可视化小,薄的突起比胞质染色。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢他们的协助迈克尔Feyder和特雷尔霍洛威在初始设置的技术和二三大野博士的实验室,他们共聚焦显微镜的访问。这项研究是由美国国立卫生研究所通过NIAAA和NINDS壁间方案。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) | Invitrogen | D-282 | ||
Methylene chloride | Mallinckrodt Chemicals | H485-06 | ||
Tungsten beads | Bio-Rad | 165-2269 | 1.7 μm diameter | |
Polyvinylpyrrolidone | Calbiochem | 529504 | ||
Tefzel bullet tubing | Bio-Rad | 165-2441 | ||
Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | ||
Helios Gene Gun | Bio-Rad | 165-2431 | ||
Isopore membrane filter paper | Millipore | TSTP02500 | 3.0 μm pore size | |
ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | ||
Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | (16% w/v) |