Una combinación de tres única longitud de onda de pulso corto láser se utiliza para generar coherente de lucha contra la dispersión Raman Stokes (CARS) y el CARS doblemente resonante (DR-CARS). La diferencia entre estas señales proporciona una mayor sensibilidad de otro modo difíciles de detectar señales de Raman coherente, lo que permite imágenes de la debilidad de dispersores Raman.
Coherente las técnicas de imagen Raman han visto un aumento dramático en la actividad durante la última década debido a su promesa de permitir sin etiquetas de imagen óptica con alta especificidad molecular 1. La sensibilidad de estas técnicas, sin embargo, es muchos órdenes de magnitud más débil que la fluorescencia, lo que requiere mili molar 1,2 concentraciones moleculares. Aquí se describe una técnica que puede permitir la detección de concentraciones débiles o de baja de Raman-activa las moléculas mediante la amplificación de su señal con la obtenida de dispersores Raman fuertes o abundantes. La interacción de corto láseres pulsados en una muestra biológica genera una variedad de señales coherentes dispersión Raman, cada uno de los cuales llevan la información química única de la muestra. Normalmente, sólo una de estas señales, por ejemplo coherente de lucha contra la dispersión Raman Stokes (CARS), se utiliza para generar una imagen, mientras que los demás se descartan. Sin embargo, cuando estas señales, incluyendo CARS 3-color y mezcla de cuatro ondas (FWM), se recogen y se compara con la señal CARS, de lo contrario difícil de detectar información se puede extraer 3. Por ejemplo, los automóviles doblemente resonante (DR-CARS) es el resultado de la interferencia constructiva entre dos señales de resonancia 4. Demostramos cómo ajuste de los tres rayos láser para producir DR-CARS señales a los 2845 cm -1 vibración tramo CH en los lípidos y los 2120 cm -1 CD vibraciones de estiramiento de una molécula de deuterio (por ejemplo, azúcares deuterado, ácidos grasos, etc) pueden ser utilizados para investigar tanto las resonancias Raman al mismo tiempo. En estas condiciones, además de las señales de los coches de cada uno de resonancia, una combinación de DR-CARS señal de sondeo tanto también se genera. Demostramos cómo detectar la diferencia entre la señal de DR-CARS y amplificar la señal de vibración de una molécula abundante se puede utilizar para aumentar la sensibilidad de la señal más débil. Además, demuestran que este enfoque se extiende incluso a aplicaciones en las que ambas señales son generadas a partir de moléculas diferentes, de tal manera que por ejemplo, con la fuerte señal Raman de un disolvente se puede mejorar la señal débil Raman de un soluto diluido.
Espectroscopia Raman y las imágenes Raman basado son poderosas herramientas emergentes de las ciencias bio. En la actualidad, esto es particularmente cierto para los in vivo e in vitro en el estudio del metabolismo celular y trastornos metabólicos en el procesamiento y almacenamiento de los lípidos. La mayoría de bio-macromoléculas contienen un gran número de similares, en su mayoría a base de carbón enlaces moleculares, por lo que los espectros Raman obtenidos a partir de las células y los organismos son generalmente una convolución de las contribuciones de los lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, azúcares, lípidos, etc son relativamente fáciles de para aislar a partir de estos espectros complejos, debido a su tendencia a formar gotas densas o bicapas y debido a que contienen largas cadenas con un gran número de enlaces CH alifáticos. Nuestra capacidad de aislar las proteínas específicas, aminoácidos, ARN o ADN dentro del entorno celular compleja, sin embargo, muy limitada. Esto es particularmente cierto si estas moléculas de interés sólo están presentes en concentraciones M y por debajo. En este caso, la capacidad de conseguir débiles resonancias Raman utilizando nuestro recién introducido DR-CARS diferencia técnica de imagen ofrece un enfoque poderoso para su microanálisis químico y de imagen. Es cierto que la parte más complicada de este protocolo es la alineación y sincronización del sistema láser. Cuando se inicia a partir de cero, la sincronización de los pulsos, es decir, garantizar que los pulsos se superponen en el tiempo a pesar de los diferentes caminos que toman pueden ser facilitadas por el uso de un autocorrelador pulso. Superposición espacial y temporal, una vez se logra, los coches y el DR-CARS señales deben ser fácilmente detectable. Sin embargo, la primera alineación es a menudo crudo, lo que resulta en señales débiles. La mejor práctica para la alineación de este sistema así es la generación de señales débiles al principio y luego para mejorar la potencia de la señal suavemente ajustar los espejos a lo largo de cada ruta y el ajuste de la coincidencia temporal con la fase de retardo. A pesar de los actos del espectrómetro / monocromador como deflector muy eficiente para la luz ambiente más limpio se pueden lograr resultados de operación del sistema con las luces del cuarto apagada y las cortinas o los tubos de lentes para minimizar el fondo presentado por las fuentes de luz varios otros (por ejemplo, los monitores de ordenador, indicadores luminosos, LED, etc.)
Nuestra configuración particular utiliza un solo fotón contando avalancha de fotodiodos (APD) y detectores de tiempo correlacionada conteo de fotones simples (TCSPC) para la detección de hardware 5. Esto nos permite detectar señales muy débiles de ruido relativamente bajo, pero muchos grupos se han encontrado tubos fotomultiplicadores (PMT), con ganancia variable ventaja al tomar medidas similares. La ventaja de la PMT es que ofrecen ganancia variable y tienen un área de detección mucho más grande que se puede simplificar el alineamiento del detector. Además, nuestra configuración utiliza las etapas piezoeléctrico para traducir el objetivo con el fin de lograr la exploración del haz. La ventaja de esto es que tenemos la posibilidad de regresar a cualquier punto dentro de la imagen escaneada con anterioridad con un alto grado de precisión y tomar medidas adicionales, como espectros Raman espontánea. Otros grupos han tenido éxito utilizando análisis conjuntos de espejo, o las unidades de exploración confocal incluso todo, como el sistema Olympus FluoView, que ofrece una imagen mucho más rápido, pero es limitado en su capacidad de volver precisamente a ubicaciones arbitrarias dentro de una imagen.
Puesta a punto del láser para que coincida con la resonancia Raman es también un paso crítico que puede ser necesaria una optimización. A pesar de los picos Raman se puede conocer la intensidad máxima de pico espectral obtenida de DR-CARS y los coches no se corresponde necesariamente con el máximo del pico Raman espontánea. Esto se debe a la interferencia intrínseca de las señales generadas por la mezcla de cuatro ondas dando lugar a una señal de fondo no resonante y automóviles, lo que distorsiona los espectros de CARS en relación con los espectros Raman espontánea. La ubicación del espectro del pico de la señal de los coches se pueden calcular, pero un enfoque más práctico es sintonizar el OPO en varias etapas, a través de pequeñas espectral de la ubicación prevista de la resonancia Raman. Este proceso debería producir un máximo claro. De hecho, para la mayor sensibilidad del DR-FWM resonancias tanto deben estar sintonizados a este máximo.
Un último problema potencial del enfoque DR-CARS también tiene que ser discutido, es decir, la señal de DR-CARS dependerá de una distribución homogénea de la molécula de amplificación Raman-activa. Para la mayoría de los objetos biológicos, esto bien podría ser la amplia resonancia OH del agua, que es abundante y omnipresente casi. El agua es, sin embargo, excluidas de las regiones hidrofóbicas con una célula, como las gotas de lípidos, lo que lleva una distorsión de las señales obtenidas cuando se utiliza la resonancia de agua para ampliar los modos de lípidos. En nuestro ejemplo, hemos utilizado una solución de glucosa deuterado para generar una señal fácilmente detectables y abundante de la muestra biológica. Del mismo modo, deuterado agua o deuterado buffe biológicars, como d-HEPES se podrían utilizar. En nuestro ejemplo, las gotas de lípidos en el C. gusano elegans fueron lo suficientemente pequeño como para contener siempre tanto, la solución de glucosa y lípidos deuterado en el punto del láser centrado de nuestro sistema. Sin embargo, esto no es cierto en general. Un ejemplo concreto sería adipocitos, que generan las gotas de lípidos más grandes dentro de su citoplasma. Esto significa, cualquier experimento realizado con la técnica del DR-CARS requiere una cuidadosa preparación y control de los experimentos para comprobar los resultados.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría dar las gracias a Iwan Schie y Sebastián Wachsmann-Hogiu por sus contribuciones en el desarrollo de la técnica del DR-CARS. Semanas Tyler agradece el apoyo del Programa Académico de Lawrence Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser está agradecido por el apoyo de la Asociación Americana del Corazón a través del programa Grant-in-Aid. Este trabajo también fue apoyado en parte por fondos de la Fundación Nacional de Ciencias. El Centro para la Biofotónica, una ciencia NSF y el Centro de Tecnología, está dirigido por la Universidad de California, Davis, en virtud del Acuerdo de Cooperación No. 0120999 PHY. También se reconoce el apoyo del Centro de UCD Clínica Ciencia Traslacional en el número de concesión UL1 RR024146 del Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |