Axoplasm Isolatie van Rat heupzenuw

Summary

Demonstreren we een protocol voor axoplasm isolatie van volwassen ratten heupzenuw op basis van dissectie van de zenuw bundels en incubatie in hypotone medium om myeline release en lyseren niet-axonale structuren, gevolgd door extractie van de resterende axon-verrijkt materiaal.

Abstract

Isolatie van pure axonale cytoplasma (axoplasm) van perifere zenuwen is van cruciaal belang zijn voor biochemisch onderzoek van de vele biologische processen. In dit artikel tonen we en beschrijven een protocol voor axoplasm isolatie van volwassen ratten heupzenuw op basis van de volgende stappen: (1) dissectie van de zenuw bundels en de scheiding van bindweefsel, (2) incubatie van korte segmenten van de zenuw bundels in hypotone medium aan myeline release en lyseren niet-axonale structuren, en (3) extractie van de resterende axon-verrijkt materiaal. Proteomics en biochemische karakterisering van deze voorbereiding heeft bevestigd dat een hoge mate van verrijking voor axonale componenten.

Protocol

Dit protocol maakt axoplasm isolatie met een minimalisering van gliale en vasculaire besmetting van de weefsels. De methode levert ongeveer 70 tot 100 ug totaal eiwit per axoplasm een ​​8-10 weken oud Wistar rat. 1. Ontleden bil Zenuwen Euthanaseren twee ratten door CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie. Bevestig dood door palperen bij gebrek aan hartslag voor het begin van dissectie. Uitstrijkje van de dissectie gebied met 70% ethanol. <l…

Discussion

Biochemische en proteomics analyses hebben bevestigd dat deze procedure serum en gliale cel besmetting ³ vermindert in vergelijking met de eerder beschreven methoden voor het axoplasm isolatie door mechanisch persen ^1. We hebben gebruik gemaakt van deze axoplasm isolatie protocol om dyneine op basis van retrograde signalering verkennen na heupzenuw verwonding ^2, en het nut te hebben in de exploratie van de vele andere processen in de volwasseneneducatie perifere zenuwen, met inbegrip van…

Materials

• Male Wistar rats (8-10 weeks old)
• PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml
• Eppendorfs for 1.5 ml
• Sterilized plastic dishes 35 mm
• Dissecting tools including: scissors and fine forceps
• Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).