Vermi transgenici sono comunemente utilizzati in C. elegans Ricerca. Descritto è un protocollo semplice, ma efficace, di introdurre transgeni in vermi mediante bombardamento biolistic con DNA particelle rivestite d'oro. Lo sforzo ei risultati del bombardamento reggono bene il confronto con microiniezione per la produzione di animali transgenici.
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Articolo metodologico
Generazione di transgenici C. elegans Di Trasformazione Biolistic
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Il numero di laboratori che si servono libero nematode C. vita elegans è in rapida crescita. La popolarità di questo modello biologico è attribuita ad un tempo di generazione rapida e breve vita, la manutenzione facile e poco costoso, genoma completamente sequenziato, e vasta gamma di risorse RNAi e animali mutanti. Inoltre, l'analisi della C. elegans genoma ha rivelato una grande somiglianza tra vermi e vertebrati superiori, il che suggerisce che la ricerca di vermi potrebbe essere un'aggiunta importante a studi condotti nei topi tutto o in cellule in coltura. Un aspetto importante della ricerca e worm è la capacità di utilizzare animali transgenici per studiare la localizzazione dei geni e la funzione. Animali transgenici possono essere create sia tramite microiniezione della linea germinale verme o attraverso l'uso di bombardamento biolistic. Bombardamento è una tecnica più nuova ed è meno familiare ad una serie di laboratori. Qui descriviamo un semplice protocollo per generare i vermi transgenici dai bombardamenti biolistic con particelle d'oro con il Bio-Rad sistema PDS-1000. Rispetto a microiniezione del DNA in ermafrodita germinale, questo protocollo ha il vantaggio di non richiedere particolari competenze da parte dell'operatore per quanto riguarda l'identificazione o l'esecuzione di anatomia verme microiniezione. Ulteriori più linee transgeniche sono solitamente ottenuti da un singolo bombardamento. Anche in contrasto con microiniezione, bombardamento biolistic produce animali transgenici con entrambi gli array extracromosomico e transgeni integrato. La possibilità di ottenere integrato linee transgeniche possono evitare l'uso di protocolli mutageno di integrare DNA estraneo. In conclusione, bombardamento biolistic può essere un metodo interessante per la generazione di animali transgenici, soprattutto per gli investigatori non sono interessati a investire il tempo e lo sforzo necessario per diventare abili a microiniezione.
Protocollo
Panoramica
Tradizionalmente vermi transgenici sono stati generati da microinjecting DNA transgene nel C. elegans germinale 1,2,3,4. Anche se di successo, questo approccio richiede attrezzature specializzate e lo sviluppo di esperienza con l'anatomia vite senza fine e la tecnica di microiniezione. Più di recente bombardamento biolistic è stato sviluppato come un approccio alternativo che utilizza rivestite di DNA particelle d'oro per introdurre DNA estraneo nella linea germinale 5,6. Questo approccio richiede investimenti meno tempo in termini di pratica per avere successo.
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Discussione
Bombardamento Biolistic è un metodo semplice per introdurre DNA estraneo in molti organismi, tra cui C. elegans 1,5,6,7,16. Si basa su particelle d'oro che formano un complesso con il DNA in presenza di CaCl 2. Poliammine cationiche, come spermidina, proteggere il DNA dalla degradazione nucleasi in vivo. Dal momento che spermidina è una molecola labile, è importante conservarlo in piccole aliquote a -20 ° C, e fare la giusta soluzione prima di eseguire il bombardamento. Come abbiamo de.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di avviamento presso l'Università di Pittsburgh e NIH concedere AG028977 a ALF
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Particelle d'oro | Inbio gold | BD021 | 1micron |
| Kit per midiprep | Qiagen | 12143 | |
| Spermidina | Sigma-Aldrich | S4139 | |
| Protamina | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Macroportatori | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Sistema PDS-1000/He Hepta | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Disco di rottura | Bio-Rad | 165-2330 | |
| Nistatina | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Streptomicina | MP Biomedicals | 100556 |
Riferimenti
- Evans, T. C. Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA tr....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation
Posted by JoVE Editors on 12/12/2012. Citeable Link.
The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation, was incorrect.
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