Un test per misurare l'attività di Escherichia coli Inducibile Lisina Decarboxyase

Sommario

L'attività della decarbossilasi inducibile lisina è monitorato facendo reagire il substrato L-lisina e il prodotto cadaverina con 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acido per formare addotti che hanno solubilità differenziale in toluene.

Abstract

Escherichia coli è un batterio intestinale che è in grado di crescere in un ampio intervallo di valori di pH (pH 5 - 9) ¹ e, incredibilmente, è in grado di sopravvivere acido estrema sottolinea anche il passaggio attraverso lo stomaco dei mammiferi in cui il pH può scendere al livello più basso come pH 1 - ² 2. Per consentire ad una vasta gamma di sopravvivenza a pH acido, E. coli possiede quattro diversi decarboxylases aminoacido inducibile che decarbossilano loro substrato amino acidi in un protone-dipendente aumentando così il pH interno. Il decarboxylases includono il acido glutammico decarboxylases Gada e GadB ^3, l'arginina decarbossilasi Adia ^4, la lisina decarbossilasi LdcI ^{5, 6} e l'ornitina decarbossilasi SpeF ^7. Tutti questi enzimi utilizzano piridossale-5'-fosfato come co-fattore ⁸ e funzione con membrana interna substrato-prodotto antiporters che rimuovono i prodotti decarbossilazione al supporto esterno in cambio di substrato fresco ^2. Nel caso di LdcI, la lisina-cadaverina antiporter si chiama Cadb. Recentemente, abbiamo determinato la struttura a raggi X di cristallo di LdcI a 2.0 Å, e abbiamo scoperto un romanzo piccole molecole legato LdcI il severo guanosina regolatore risposta 5'-difosfato, 3'-difosfato (ppGpp) ^14. La risposta rigorosa verifica quando le cellule in crescita esponenziale esperienza privazione nutritiva o uno di una serie di sollecitazioni di altri ^9. Di conseguenza, le cellule producono ppGpp che porta ad una cascata di segnali si conclude con il passaggio da una crescita esponenziale alla crescita fase stazionaria ^10. Abbiamo dimostrato che ppGpp è un inibitore specifico della LdcI ^14. Qui descriviamo il test lisina decarbossilasi, modificato dal test sviluppato da Phan et al. ^11, che abbiamo usato per determinare l'attività di LdcI e l'effetto di pppGpp / ppGpp su tale attività. La reazione di decarbossilazione LdcI rimuove l'α-carbossi gruppo di L-lisina e produce anidride carbonica e la cadaverina poliammine (1,5-diaminopentane) ^5. L-lisina e cadaverina si può reagire con 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acido (TNBS) a pH elevato per generare N, N-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) e N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina), rispettivamente ^11. Il TNP-cadaverina può essere separato dal TNP-lisina in quanto il primo è solubile in solventi organici come il toluene, mentre la seconda non lo è (vedi figura 1). Il range lineare del test è stato determinato empiricamente utilizzando purificata cadaverina.

Protocollo

1) Reagenti ed apparecchiature

1. In primo luogo, preparare le seguenti tre soluzioni: 1 ml di soluzione A, che si compone di 8 mM L-lisina, 100 mM di sodio 2 - (N-Morpholino) ethanesulphonic acido (MES) pH 6,5, 0,2 mM nucleotide, in cui il nucleotide è o: guanosina difosfato (GDP), guanosina trifosfato (GTP), guanosina 5'-difosfato, 3'-difosfato (ppGpp), o guanosina 5'-trifosfato, 3'-difosfato (pppGpp), 0,1 mM piridossal 5'-fosfato (PLP), e 1 mM β-mercaptoetanolo / (β-ME). 1 ml di soluzione B che consiste in 100 mM di sodio MES pH 6,5, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME, e 50 nM LdcI. LdcI è stato purificato come descritto nella Snider et al. ⁶ e Kanj....

Discussione

Nel test lisina decarbossilasi, TNBS viene fatto reagire con le ammine primarie di L-lisina e cadaverina per formare TNP-lisina e TNP-cadaverina addotti (Figura 1). A causa della presenza del gruppo carbossilico sul TNP-lisina, questo addotto rimane solubile in acqua, mentre il TNP-cadaverina, manca il gruppo carbossilico, è in grado di partizionamento in toluene ^11. Questo tipo di analisi può essere utilizzata più ampiamente su altri tipi di aminoacidi in cui la perdita di un gruppo carbossilico si verifica .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido 2,4,6-trinitrobenzensolfonico	Sigma-Aldrich	P2297
0,1 mM piridossale 5’-fosfato (PLP)	Sigma-Aldrich	P9255
Cadaverina	Sigma-Aldrich	D22606
Piastre in polistirene da 96 pozzetti	Sarstedt Ltd
Piastra in quarzo da 96 pozzetti	Hellma
Piastra riscaldante digitale VWR	VWR international
ThermoStat Plus	Eppendorf
Piastre in polipropilene da 2,0 mL, 96 pozzetti	Axygen Scientific	P-DW-20-C
Pipetta ripetitiva Handy Step	Brand GmbH
Punte per pipetta ripetitiva da 12,5 mL	Brand GmbH	702378
Lettore di piastre SpectraMax 340PC	SpectraMax