Bakteriell Leverans av RNAi Effektenheter: Transkingdom RNAi
Summary
För utveckling av RNA-interferens (RNAi)-baserade terapier, var en roman strategi utvecklats, transkingdom RNAi (tkRNAi). Denna teknik använder icke-patogena bakterier att producera och leverera terapeutiska korta hårnål RNA (shRNA) i målceller. Här var tkRNAi framgång använts för återföring av klassisk ABCB1-medierad multidrogresistensgenen (MDR) av cancerceller.
Abstract
RNA-interferens (RNAi) är en hög effektiv mekanism för specifika hämning av mRNA uttryck. Förutom dess potential som ett kraftfullt laboratorium verktyg verkar RNAi väg att lovande för terapeutisk användning. För utveckling av RNA-interferens (RNAi)-baserade terapier, leverans av RNAi-förmedlande agenter till målceller är en av de största hindren. En roman strategi för att övervinna detta hinder är transkingdom RNAi (TK RNAi). Denna teknik använder icke-patogena bakterier, t.ex. Escherichia coli, att producera och leverera terapeutiska korta hårnål RNA (shRNA) i målceller att inducera RNAi. En första generationens tk RNAi-medla vektor, TRIP, innehåller bakteriofag T7 promotor för uttryck reglering av ett terapeutiskt shRNA av intresse. Dessutom har resan Inv locus från Yersinia pseudotuberculosis som kodar invasin, som tillåter naturlig icke-invasiv bakterier att komma in β1-integrin-positiv däggdjursceller och HlyA genen från Listeria monocytogenes, som producerar listeriolysin O. Detta enzym kan den terapeutiska shRNA att fly från inträde blåsor i cytoplasman i målcellen. TRIP konstruktioner införs till en kompetent icke-patogena Escherichia coli stam som kodar T7 RNA-polymeras är nödvändiga för T7 promotorn driven syntes av shRNAs. En väldefinierad cancer-associerade målmolekyl för olika RNAi strategier ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Denna ABC-transportör fungerar som en drog extrudering pump och förmedlar den "klassiska" ABCB1-medierad multidrogresistensgenen (MDR) fenotyp av mänskliga cancerceller som kännetecknas av en viss korsresistens mönster. Olika ABCB1-uttryckande MDR cancerceller behandlades med anti-ABCB1 shRNA uttryck vektor med E. coli. Detta förfarande resulterade i aktivering av RNAi banorna inom cancerceller och en betydande ner reglering av ABCB1 kodning mRNA samt motsvarande drogen extrudering pump. Följaktligen var ackumulering av läkemedlet förbättras i den orörda resistenta cancerceller och MDR fenotypen den omvända. Med hjälp av denna modell uppgifterna ger proof-of-concept som tk RNAi är lämplig för modulering av cancer-associerade faktorer, t.ex. ABCB1, i humana cancerceller.
Protocol
Discussion
Cellen Antalet seedade för infektion och motsvarande MOI använts, kritiskt beroende av cellinjer under observation och deras hastighet av tillväxt. Att hitta optimala cell nummer för sådd, är pre-experiment för att bestämma hastigheten på tillväxt rekommenderas starkt. Utöver detta bör olika MOIS testas på grund av begränsad omfattning som cellerna tål bakteriell invasion utan att dö av stress. Den optimala tidpunkt då ner regleringen av gener under uppsikt kan variera. Det rekommenderas att utföra exp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes av bidrag nr. 01GU0615 av "Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agar | Biochrom AG | 214050 | ||
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | ||
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | ||
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | ||
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | ||
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | ||
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
Riferimenti
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J.H. & Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H. MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr. Drug Targets 7, 813-821 (2006).
- Lage, H. An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem. Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).
- Lage, H. Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers. Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).
- Nguyen, T.A. & Fruehauf J.H. Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing. Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).
- Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A. & Lage, H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi). FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).
- Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C. & Lage, H. Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference. Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).
- Stein, U. et al. Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA. Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).
- Xiang, S., Fruehauf, J. & Li, C.J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).
