In vivo micro-circolazione di misura nel muscolo scheletrico da Intra-vitale Microscopia

Summary

Un nuovo metodo versatile per l'osservazione del microcircolo è presentato. E 'considerato adatto per osservazione a lungo termine, e per la combinazione con interventi biologici pharmacophysiological o molecolare.

Abstract

BACKGROUND: fattori di regolamentazione e la fisiologia dettagliata del microcircolo in vivo sono rimasti non del tutto chiarita, dopo molti differenti modalità di imaging aveva inventato. Mentre molti parametri macroscopici del flusso di sangue riflettono velocità di flusso, i cambiamenti nella velocità del flusso sanguigno e di globuli rossi (RBC) flusso non regge relazione lineare nelle osservazioni microscopiche. Ci sono rapporti di discrepanza tra RBC velocità e flusso di RBC, RBC flusso e il volume di flusso di plasma e di eterogeneità spaziale e temporale di regolazione del flusso nei tessuti periferici nelle osservazioni microscopiche, una base scientifica per la necessità di studi più dettagliati nella regolazione del microcircolo con microscopia intravitale.

METODI: Abbiamo modificato il metodo di Jeff Lichtman di osservazione microscopica in vivo dei muscoli sternocleidomastoideo mouse. I topi sono anestetizzati, ventilato, e iniettati con PKH26L-fluorescente GR etichettati per l'osservazione microscopica.

RISULTATO & CONCLUSIONI: globuli rossi fluorescente vengono individuati e distinti anche da un ampio campo ottico. Contrazione muscolare evocata da aumentare la stimolazione elettrica indotta nel flusso di RBC. Quantificazione di altri parametri tra cui la velocità dei globuli rossi e la densità dei capillari erano fattibili. I topi ben tollerato la chirurgia, l'iniezione di globuli rossi macchiato, osservazione al microscopio, e la stimolazione elettrica. Nessun danno muscolare o vaso sanguigno è stato osservato, suggerendo che il nostro metodo è relativamente meno invasivo e adatto per osservazioni a lungo termine.

Protocol

RBC membrana colorazione Topo globuli rossi sono stati corretti dal ceppo di topi con lo stesso eparinizzazione. Topo RBC sono state colorate con PKH26 colorante (551/567 nm; Rosso fluorescente kit linker cellulari, Sigma, USA). RBC sono state lavate in PBS e incubate con una soluzione di 2μM PKH26 colorante per 5 minuti a temperatura ambiente. La reazione è stata bloccata con l'aggiunta di plasma (inattivato con il calore per 1 ora a 65 ° C in anticipo) e incubate per 1 minuto. </li…

Discussion

Importanti punti TECNICHE sono i seguenti: (1) mantenimento dello stato fisiologico dell'animale (ventilazione, perfusative pH della soluzione, la temperatura corporea), (2) volume di iniezione del macchiato RBC, e (3) condizioni per l'osservazione (lente ottimale selezione, intensità di fluorescenza). Potenziali applicazioni future sono i seguenti: (a) combinazione con interventi biologici pharmacophysiological e / o molecolari, (b) osservazione a lungo termine di arterio / arteriolo-sclerosi e neovascolarizzazione.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
PKH26 dye		Sigma		551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice	Animal			Three to six month old males
pentobarbital				anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.