Larve di Drosophila melanogaster fornire un sistema modello ideale per studiare i meccanismi di trasporto assonale in nervi larvale segmentale. Utilizzando questa procedura, 3 ° larve instar portatori di mutazioni varie può essere paragonato a larve wild-type.
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Articolo metodologico
Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3 Rd Instar Drosophila I preparativi larvali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Drosophila melanogaster sta emergendo come un potente sistema modello per studiare lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso, in particolare a causa della sua genetica e conveniente genoma completamente sequenziato. Inoltre, il sistema nervoso larvale è un sistema modello ideale per studiare i meccanismi del trasporto assonale, come i nervi larvale segmentale contenere fasci di assoni con i loro corpi cellulari situato all'interno del cervello e le loro terminazioni nervose finale lungo la lunghezza del corpo. Qui si descrive la procedura per la visualizzazione di proteine delle vescicole sinaptiche all'interno larvale nervi segmentale. Se fatto correttamente, tutte le componenti del sistema nervoso, con relativi tessuti come i muscoli e NMJs, rimane intatto, integro e pronto per essere visualizzato. 3 ° larve instar portatori di mutazioni diverse sono sezionati, fisso, incubate con anticorpi delle vescicole sinaptiche, visualizzati e confrontati con le larve wild-type. Questa procedura può essere adattata per diversi anticorpi diversi sinaptica o neuronale e cambiamenti nella distribuzione di una varietà di proteine può essere facilmente osservata entro larvale nervi segmentale.
Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
- Preparare 1x buffer Dissection a 128 mM NaCl, CaCl 2 4mm, 4 mm MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5 mm e 36 mm saccarosio. Il pH della soluzione a 7,2 e filtro sterilizzare.
- Preparare il fissativo con diluizione 1:1 del 16% di formaldeide e Buffer Dissection 1x.
- Preparare 1x PBT utilizzando 1x soluzione tampone fosfato (PBS) a pH di 7,2 e Triton X-100 in un rapporto 1:100.
- Preparare il 5% di albumina sierica bovina (BSA) con 0,01% Na azide in 1x PBS.
2. Preparazione per la dissezione
- Sylgard piatti vengono utilizzati per la dissezione. Prepar....
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Discussione
I nervi larvale Drosophila segmentale sono un potente sistema per lo studio dei meccanismi di trasporto assonale. Se il 3 ° instar dissezione larvale viene eseguita correttamente, tutte le componenti del sistema nervoso centrale, PNS, e tessuti associati, come i muscoli e NMJs, possono essere esaminate all'interno di una singola larva. Abbiamo adattato questo protocollo da quella pubblicata da Hurd e Saxton (1996). Questo protocollo può essere adattato anche a test altri anticorpi neuronali, ma l.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
SG è sostenuto da fondi del State University di New York a Buffalo e da John R. Oishei Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pinzette Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Puntine minutien, acciaio inossidabile | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Forbici dritte Mcpherson-Vannas, 8 cm | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, mezzo di montaggio | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Elastomero di silicone Sylgard 184 | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldeide, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Anti-topo IgG capra | Invitrogen | A-11004 |
Riferimenti
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S.
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Ristampe e permessi
