Edu सिग्नल प्रवर्धन द्वारा व्यक्तिगत कक्ष में Mitochondrial डीएनए प्रतिकृति के विज़ुअलाइज़ेशन
Summary
हम एक संवेदनशील व्यक्ति की कोशिकाओं में नए संश्लेषित mitochondrial डीएनए (mtDNA) लेबल क्रम में mtDNA biogenesis अध्ययन तकनीक विकसित की है. तकनीक EDU के समावेश के साथ एक tyramide संकेत प्रवर्धन प्रोटोकॉल (TSA) के साथ न्यूरॉन्स के subcellular डिब्बों के भीतर mtDNA प्रतिकृति कल्पना को जोड़ती है.
Abstract
Mitochondria सेलुलर ऊर्जा के प्रमुख नियामकों और mitochondrial biogenesis स्वस्थ 1-3 कोशिकाओं में mitochondria की संख्या विनियमन का एक आवश्यक घटक है . Mitochondrial biogenesis निगरानी के लिए एक दृष्टिकोण mitochondrial डीएनए (mtDNA) प्रतिकृति चार की दर को मापने है . हम एक संवेदनशील व्यक्ति की कोशिकाओं में नव संश्लेषित mtDNA लेबल क्रम में mtDNA biogenesis अध्ययन तकनीक विकसित की है. तकनीक (EDU) 5 – ethynyl – 2'- deoxyuridine tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) 8 प्रोटोकॉल mtDNA प्रतिकृति subcellular डिब्बों के भीतर न्यूरॉन्स की कल्पना के साथ 5-7 का समावेश को जोड़ती है. Edu 5 – ब्रोमो – 2 – deoxyuridine (BrdU) जैसे अन्य thymidine analogs, बेहतर है, क्योंकि प्रारंभिक लेबल 5-7 EDU के लिए क्लिक करें प्रतिक्रिया कठोर एसिड उपचार या एंजाइम हज़म कि BrdU मिलान को उजागर करने के लिए आवश्यक हैं की आवश्यकता नहीं है . Edu की मामूली लेबलिंग अन्य सेलुलर 9-10 मार्कर के साथ अपने निगमन के प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है . कल्पना करने और mtDNA biogenesis यों की क्षमता mitochondrial biogenesis को विनियमित और दवा विषाक्तता, उम्र बढ़ने, कैंसर और neurodegenerative रोगों के साथ जुड़े रोगजनन में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा करने के लिए इस्तेमाल किया तंत्र की जांच के लिए एक आवश्यक उपकरण प्रदान करता है. हमारी तकनीक संवेदी न्यूरॉन्स के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू होता है. mtDNA biogenesis को मापने के लिए इस तकनीक का उपयोग दोनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सामान्य सेलुलर फिजियोलॉजी बिगड़ा रोग राज्यों की समझ को आगे बढ़ाने में महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है है.
Protocol
Discussion
हम एक संवेदनशील व्यक्ति EDU के एक tyramide संकेत प्रवर्धन का उपयोग कोशिकाओं में नव संश्लेषित mtDNA लेबल परख विकसित किया है. इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान सबसे बड़े मुद्दों में से एक coverslips बीच असंगत परिणाम था. Invitrogen किट प्रोटोकॉल के लिए परिवर्तन किए गए व्यक्ति coverslips पर छोटे मात्रा मिश्रण और मास्टर समाधान सभी coverslips के लिए उपयोग करने के लिए से बचने के. 75-80 प्रत्येक 12 मिमी परिपत्र कांच coverslip के लिए इस्तेमाल किया μL एक आदर्श के लिए पूरी तरह से सतह क्षेत्र को कवर जबकि नमूनों के बीच अनुरूप परिणाम देने के लिए पर्याप्त समाधान प्रदान मात्रा है. ऊष्मायन समय और अभिकर्मक सांद्रता अनुकूलित थे, लेकिन उनके लिए समायोजन के साथ सुधार देखा जा सकता है.
प्रोटोकॉल प्रत्येक प्रक्रिया एक बार चलाने के लिए डिज़ाइन किया गया है. हालांकि, कदम से कुछ नए समाधानों के साथ दोहराया गया नमूने है कि पहले प्रयास के बाद असफल रहा ठीक. विशेष रूप से, Edu क्लिक करें प्रतिक्रिया कदम (3.4-3.6) पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि के बिना दोहराया गया है. विरोधी ओरेगन एंटीबॉडी ग्रीन एचआरपी (4.1-4.3) ऊष्मायन और tyramide (4.4-4.5) प्रवर्धन कदम भी दोहराया गया है, लेकिन अधिक बार वृद्धि की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की वजह से शोर अनुपात करने के लिए एक गरीब संकेत में परिणाम है.
सबसे संवेदनशील अभिकर्मकों क्लिक करें यह Edu बफर (घटक जी) और क्लिक करें यह Edu Microplate परख किट से खरगोश विरोधी ओरेगन ग्रीन एचआरपी एंटीबॉडी (मैं घटक) Additive हैं. क्लिक करें यह Edu बफर Additive धीरे – धीरे समय के साथ पीले रंग बदल जाता है जब 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस और 6-12 महीने के बीच काफी darkens. सी -20 ° पर क्लिक करें यह Edu बफर Additive का भंडारण इस मुद्दे पर कम होगा. लेबलिंग और tyramide प्रवर्धन कदम का सबसे अच्छा काम है जब विरोधी ओरेगन खरगोश ग्रीन एचआरपी एंटीबॉडी MilliQ DH 2 ओ में पुनर्गठन के 4-6 महीने के भीतर प्रयोग किया जाता है
mtDNA में EDU के हल्के लेबलिंग अतिरिक्त सेलुलर 9-11 मार्करों के साथ प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है और अन्य thymidine analogs पर इस तकनीक का (BrdU 5) – ब्रोमो – 2 – deoxyuridine, जो ठीक करने के लिए एक कठोर उपचार की आवश्यकता के रूप में, उपयोगिता को बढ़ाता है डीएनए के भीतर अपनी मिलान. हमारे 11-12 प्रयोगशाला और दूसरों को 13-15 सफलतापूर्वक BrdU mtDNA लेबल का इस्तेमाल किया है. BrdU लेबलिंग तकनीक EDU के लिए इस्तेमाल किया एक के समान है, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण अंतर (चित्रा 5) है. Permeabilization ऊपर सूचीबद्ध कदम (3.1-3.2) के बाद, BrdU मिलान एक विकृतीकरण कदम के साथ बरामद किया है (37 पर 30 मिनट के लिए 2 एन एचसीएल ° सी 1X पीबीएस में तीन washes के द्वारा पीछा किया). BrdU तो BrdU के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल है (वेक्टर प्रयोगशालाओं TSA किट से 1% अवरुद्ध समाधान में 1:50 और पतला 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात incubated). एक माध्यमिक एंटीबॉडी कदम BrdU संकेत (बकरी आईजीजी विरोधी माउस TSA # 2 # 5 किट, 1:100 पतला 1% अवरुद्ध समाधान में से एचआरपी संयुग्मित और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated) से पहले बढ़ाना करने के लिए की जरूरत है TSA कदम (4.3-4.5 ऊपर). लेबल mtDNA दो thymidine analogs, Edu और BrdU, दोहरी लेबल प्रयोगों जहां mtDNA sequentially पल्स लेबलिंग 11 मानदंड में लेबल किया जा सकता है है प्रदर्शन के लिए फायदेमंद है .
हमारी प्रयोगशाला Edu और mtDNA के BrdU लेबलिंग का उपयोग कर रहा है मधुमेह न्युरोपटी, मधुमेह की एक आम समस्या के संदर्भ में mitochondrial biogenesis का विनियमन की जांच. हम सफलतापूर्वक संकेत प्रवर्धन mtDNA biogenesis में व्यक्तिगत 11-12 न्यूरॉन्स में बदलाव को मापने का इस्तेमाल किया है. इस तकनीक को अन्य mtDNA प्रतिकृति और कारोबार के या दवाओं है कि mtDNA संश्लेषण को बाधित की पहचान के लिए तंत्र का पता लगाने के लिए डिज़ाइन प्रयोगों में उपयोगी हो जाएगा. इसके अलावा, amplifying Edu और BrdU संकेतों के बुनियादी सिद्धांतों के अन्य अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है कि उपाय डीएनए प्रतिकृति या मरम्मत.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों एन एस 38,849 डी.के. और 076,160, किशोर मधुमेह मधुमेह में जटिलताओं के अध्ययन के लिए रिसर्च फाउंडेशन केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था, न्यूरोलॉजी अनुसंधान और डिस्कवरी और ए अल्फ्रेड Taubman चिकित्सा अनुसंधान संस्थान के लिए कार्यक्रम मिशिगन विश्वविद्यालय. यह काम आकृति विज्ञान और मिशिगन मधुमेह अनुसंधान और प्रशिक्षण केन्द्र, मधुमेह और पाचन और गुर्दा रोग के राष्ट्रीय संस्थान से राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान डी.के. २०,५७२ 5P60 संस्थान द्वारा वित्त पोषित की छवि विश्लेषण कोर का इस्तेमाल किया. लेखकों आण्विक जांच / Invitrogen से अपने पर बहुमूल्य सलाह के लिए धन्यवाद स्कॉट टी. क्लार्क विभिन्न क्लिक करें – यह किट और अभिकर्मकों के उदार दान लेबलिंग Edu प्रवर्धन तकनीक के प्रारंभिक विकास का समर्थन Edu.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 12 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-82 | ||
| 245 mm x 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | ||
| Parafilm M | Fisher Scientific | PM-996 | ||
| paraformaldehye | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8532 | ||
| Phosphate buffered saline 10X solution | Fisher Scientific | BP399 | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-7M | ||
| Hydrogen peroxide, 30% in water | Fisher Scientific | BP2633 | ||
| Click-iT EdU Microplate Assay Kit | Invitrogen | C10214 | ||
| TSA Kit #12, with HRP—goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20922 | ||
| TSA Kit #15, with HRP–goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20925 | ||
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | ||
| Polyclonal rabbit Neurofilament antibody | Chemicon | AB1981 | ||
| Mouse monoclonal anti-BrdU antibody | Vector Laboratories | VP-B209 | ||
| TSA Kit #2, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20912 | ||
| TSA Kit #5, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20915 |
Riferimenti
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