Bu protokol, canlı diseksiyonu tartışıyor.<em> Drosophila</em> Görüntüleme amacıyla mikrotübül parça GFP etiketli aksonal vezikül hareketi larvaları.
Abstract
Aksonal taşıma mekanizmaları nedenlerine açıklık uzun mesafe taşımacılığı hatalarına farklı nörolojik hastalıklar nasıl etkilediğini belirlemede çok önemli olduğunu göstermiştir. Bu temel süreç Hataları nöronal işleyişi ve gelişimi üzerinde zararlı etkileri olabilir. Biz, ortaya çıkarmak için tasarlanmış bir diseksiyon protokol geliştirdiler<em> Drosophila</em> Larva segmental sinirler gerçek zamanlı olarak aksonal taşıma görüntülemek için. Biz Hurd ve larva segmental sinirler immunolocalizatin için kullanılan Saxton (1996) tarafından yayınlanan bir canlı görüntüleme için bu protokol adapte var. Dikkatli diseksiyon ve uygun tampon koşulları disseke larvaların ömrünü maksimize etmek için kritik öneme sahiptir. Düzgün yapılmazsa, disseke larvaları fizyolojik şartlar altında 2-3 saat için sağlam vezikül taşıma göstermiştir. Biz UAS GAL4 yöntemi kullanın<sup> 1</sup> Ifade GFP-etiketli farklı nöronal GAL4 sürücülerini kullanarak, tek bir larva segmental sinirler akson veya birçok aksonlar içinde APP veya synaptotagmin vezikül. Diğer floresan etiketli işaretleyicileri, örneğin mitochrondria (MitoTracker) veya lizozomlar (LysoTracker), görüntülemeden önce larva uygulanan olabilir. GFP-vezikül hareket ve parçacık hareketi ayrı dalga boylarını kullanan eş zamanlı olarak görülebilir.
Protocol
1. Reaktiflerin hazırlanması Diseksiyonu tampon hazırlama, 7.2 ve sterilize 128 mM NaCl, 1mm EGTA, 4 mM MgCl 2, 2mm KCl, 5mM Hepes ve 1000 ml, PH 36 mM Sakkaroz: Aşağıdaki bileşikleri ekleyerek hazırlayın . 2. Diseksiyon için hazırlanması Siligard küp jel yaklaşık bir inç genişliğinde, 1 inç uzunluğunda ve yüksekliği yaklaşık 1cm kesilir. Jel küp Diseksiyon sırasında bir bardak slayt yerleştirilir. Küpleri birden fazla kez k…
Discussion
Drosophila larva segmental sinirler içinde sinaptik vezikül taşıma in vivo görüntüleme aksonal taşıma mekanizmaları çalışmak için güçlü bir araçtır. Daha önce larva sinirler içinde tekrarlar genişleme vezikül taşımacılığı 3 dinamiklerini nasıl etkilediğini aydınlatmak için genişletilmiş polyQ tekrarlar ifade taşıma dinamikleri değerlendirmek için bu protokolü kullandık. Bu protokolü kullanarak vezikül hareketinin hızı, video akışı bir kymograph…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SG, Buffalo New York Devlet Üniversitesi ve John R. Oishei Vakfı fonları tarafından desteklenmektedir.
MK UB CURCA tarafından Öğrenci Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
1 Pair Micro Dissection Scissors
Fine Scientific
Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter
2 Pair Forceps
Fischer Scientific
Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps
Kuznicki, M. L., Gunawardena, S. In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons. J. Vis. Exp. (44), e2151, doi:10.3791/2151 (2010).