Экс-ово Куриного эмбриона культуры систему, пригодную для обработки изображений и микрохирургии Приложения
Summary
В этой статье мы приведем простой методологии чтобы долгосрочные<em> Экс-ово</em> Птичьего культуры эмбриона. Эта техника идеально подходит для продольной эксперименты требуют полного оптического доступа и / или стерильной транспортировки в птичьем эмбрионов.
Abstract
Понимание связи между генетическими и микросреды факторы, влияющие на нормальное и неправильного эмбрионального развития имеет основополагающее значение для открытия новых терапевтических стратегий. Достижения в области технологий визуализации позволили количественного исследования организации и созревание тела план, но поздней стадии эмбрионального морфогенеза менее ясна. Куриные эмбрионы привлекательным позвоночных животных модельной системы для такого применения из-за своей простоты культуры и хирургических манипуляций. Ранние эмбрионы могут быть культивировали в течение короткого времени на фильтровальную бумагу кольца, которое позволяет полностью оптического доступа для структурирования клетки и 1,2 судьба исследований. Изучение передовых процессов развития, таких как сердечный морфогенез традиционно осуществляется через окно яичной скорлупы 3-5, но эта техника пределы оптического доступа за счет размера окна. Ранее мы разработали простой метод культуры целых зародышей экс-ово с шестиугольными вес лодки на срок до 10 дней, что позволило высоким разрешением с помощью УЗИ 6,7. Эти культуры были трудно транспортировать, ограничивающий типы изображений инструментов, доступных для живых экспериментов. Мы здесь присутствует улучшенный оболочки менее культуре системы с экономически эффективной, портативные экологической палаты. Яйца были трещины на гамак создан полиуретановой мембраны (цепляются обертка), наложенных на окружности пластиковый стаканчик, частично заполненной стерильной водой. Размеры окружности и глубину гамак оба были важны для поддержания поверхностного натяжения, в то время как механика гамак и воды под помогли ослабить колебания индуцированного транспорта. Небольшой размер оборотной водой ванне был также разработан, с тем постоянный контроль температуры во время экспериментов. Мы демонстрируем способность к культуре эмбрионов на этом пути, по крайней мере 14 дней без морфогенный дефект или отложить и использовать эту систему в нескольких микрохирургических и визуализации приложений.
Protocol
Discussion
Оптический доступ и экспериментов в птичьего эмбриона является сложной задачей из-за ограничений яичной скорлупы. Windowing существенно ограничивает число микрососудов доступным для инъекций и микрохирургические подходы 8. В результате только ранних эмбрионов можно манипулироват?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fertile white Leghorn chicken eggs | ||||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | ||||
| Saran Wrap | ||||
| Kimwipes | Kimberly-Clark, Inc. | |||
| Rubber bands | ||||
| Warm sterile water | ||||
| 9 oz plastic cup | ||||
| 100 mm diameter Petri dish | ||||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing CO, Savannah GA | |||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma Aldrich Inc. | |||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | |||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | ||||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Sarasota FL | Model M3301L | ||
| Fluorescent microscopy | Zeiss | Z20 | ||
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Sarasota FL | |||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | |||
| Tubing | VWR | 1mm OD | ||
| 3 mL syringe | BD | |||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR |
References
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos. Dev Biol. 207, 163-175 (1999).
- Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo. Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).
- deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle. Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).
- McQuinn, T. C. High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development. Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev Biol. 41, 391-394 (1974).
