Injectie van An. stephensi Embryo's aan Malaria-resistente muggen Generate

Summary

Anopheles stephensi muggen zijn vectoren voor malaria wonen India en de rest van Azië. Deze video toont de techniek voor het uitvoeren van micro-injecties van deze soorten met transgenen die weerstand zal verlenen aan de malaria aan de mug. Een groot deel van de methodologie kunnen zien in deze video is van toepassing op micro-injectie technieken van andere muggensoorten.

Abstract

De introductie van exogene genen in het genoom van muggen nodig micro-injectie technieken afgestemd op de specifieke soorten van belang. Deze video toont een protocol methode die wordt gebruikt door de James laboratorium DNA-constructen microinject in Anopheles stephensi embryo's voor het genereren van getransformeerde muggen. Technieken voor het bereiden van micro-injectie naalden, het verzamelen en het voorbereiden van embryo's en het uitvoeren van de micro-injectie worden geïllustreerd.

Protocol

Voorbereiding van de micro-injectie: Bloed te voeden muggen: voor injectie van maandag tot en met woensdag voeden vrouwen op de vorige vrijdag. Tot en met donderdag en vrijdag, voeden vrouwen injecteren op maandag van dezelfde week. Bereid de Quartz naalden met behulp van programma 2 en isotone buffer (zie ook Materiaal). "Het leggen tube" voor de embryo's is de reguliere Drosophila cultuur flacon. Natte watten in de bodem, met een natte schijf van fil…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Injection Quartz needles		Sutter Instrument		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Quiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification