Injection d'un. Embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques

Summary

Moustiques Anopheles stephensi sont des vecteurs de la malaria qui habitent en Inde et en Asie. Cette vidéo montre la technique pour effectuer des micro-injections de cette espèce avec des transgènes qui confèrent une résistance à la malaria au moustique. Une grande partie de la méthodologie démontrée dans cette vidéo est applicable à des techniques de micro-injection d'autres espèces de moustiques.

Abstract

L'introduction de gènes exogènes dans les génomes des moustiques nécessite des techniques de micro-injection adaptés aux espèces d'intérêt particulier. Ce protocole vidéo montre une méthode utilisée par le laboratoire de James microinject constructions d'ADN dans des embryons stephensi Anopheles pour la génération de moustiques transformé. Les techniques de préparation des aiguilles de microinjection, la collecte et la préparation des embryons et l'exécution des micro-injection sont illustrés.

Protocol

Préparation à l'avance de la micro-injection: Moustiques nourrissent de sang: pour l'injection du lundi au mercredi femelles se nourrissent le vendredi précédent. Pour injecter jeudi et vendredi, les femelles se nourrissent le lundi de la même semaine. Préparer les aiguilles à quartz utilisant le programme 2 et tampon isotonique (voir matériaux). "Pose du tube" pour les embryons est le flacon de culture régulière drosophile. Coton humide …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Injection Quartz needles		Sutter Instrument		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Quiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification