Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane
Summary
Questo articolo descrive diversi metodi di coltivazione<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Biofilm su colture di cellule epiteliali delle vie respiratorie umane. Questi protocolli possono essere adattati per studiare i diversi aspetti della formazione di biofilm, compresa la visualizzazione del biofilm, colorazione del biofilm, la misurazione della unità formanti colonia (CFU) del biofilm, e studiare la citotossicità biofilm.
Abstract
Biofilm batterici sono stati associati con una serie di diverse malattie umane, ma lo sviluppo di biofilm è stata generalmente studiata su superfici non viventi. In questo articolo, si descrivono i protocolli per la formazione di biofilm Pseudomonas aeruginosa sulle cellule epiteliali delle vie respiratorie umane (cellule CFBE) crescere in coltura. Nel primo metodo (chiamato la statica Co-cultura Modello biofilm), P. aeruginosa viene incubata con cellule CFBE cresciuto come monostrati confluenti su piastre standard di coltura dei tessuti. Anche se il batterio è molto tossico per le cellule epiteliali, l'aggiunta di ritardi arginina la distruzione del monostrato abbastanza a lungo per formare biofilm sulle cellule CFBE. Il secondo metodo (chiamato la cella di flusso co-cultura Modello biofilm), comporta l'adattamento di un apparato cellulare biofilm flusso, che è spesso usato in biofilm ricerca, per ospitare un coprioggetto di vetro sostenere un monostrato di cellule confluenti CFBE. Questo monostrato viene inoculato con P. aeruginosa e una pompa peristaltica scorre mezzo fresco attraverso le cellule. In entrambi i sistemi, i biofilm batterici forma entro 6-8 ore dopo l'inoculazione. Visualizzazione dei biofilm è migliorata con l'uso di P. aeruginosa, i ceppi che esprimono costitutivamente la proteina fluorescente verde (GFP). La statica e Cella di flusso co-cultura saggi biofilm sono sistemi modello per l'inizio del P. infezione aeruginosa della fibrosi cistica (CF) del polmone, e queste tecniche permettono diversi aspetti di P. formazione di biofilm aeruginosa e virulenza da studiare, tra citotossicità biofilm, la misurazione di biofilm CFU, e la colorazione e la visualizzazione del biofilm.
Protocol
Discussion
I biofilm sono comunità di batteri che si formano in risposta a stimoli ambientali. Questi segnali ambientali globali portare a cambiamenti normativi all'interno di ogni batterio, con conseguente legame ad una superficie, l'aggregazione, la produzione di esopolisaccaridi, e altri fenotipi quali aumento della resistenza agli antibiotici 10. Nel corso degli ultimi due decenni, molte prove ha sostenuto l'ipotesi che i biofilm giocano un ruolo importante nella patogenesi delle infezioni croniche. Per…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare G. O Toole per la guida e suggerimenti per lo sviluppo di questi modelli. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Fibrosi Cistica (ANDERS06F0 per GGA, STANTO07RO e STANTO08GA a BAS), il National Institutes of Health (T32A107363 per GGA e R01-HL074175 a BAS), e il Centro nazionale per le risorse Centri di Ricerca di Eccellenza di Ricerca Biomedica (COBRE P20-RR018787 di BAS).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs, Butler, PA | 060319131616 | ||
| FCS2 chamber controller | Bioptechs, Butler, PA | 060319-2-0303 | ||
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs, Butler, PA | PH 40-1313-0319 | ||
| MEM | Mediatech, Manassass, VA | #10-010-CV | ||
| MEM without phenol red | Mediatech, Manassass, VA | Mediatech, Manassass, VA |
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