Co-culture des modèles Pseudomonas aeruginosa Les biofilms Cultivé sur le Live cellules des voies respiratoires de l'homme
Summary
Ce document décrit les différentes méthodes de plus en plus<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Biofilms sur des cultures de cellules des voies respiratoires épithéliales humaines. Ces protocoles peuvent être adaptés pour étudier les différents aspects de la formation de biofilms, y compris la visualisation du biofilm, la coloration du biofilm, la mesure de la unités formant colonie (UFC) du biofilm, et étudier la cytotoxicité de biofilm.
Abstract
Biofilms bactériens ont été associés à un certain nombre de différentes maladies humaines, mais le développement du biofilm a généralement été étudié sur des surfaces non-vivantes. Dans cet article, nous décrivons les protocoles de formant des biofilms de Pseudomonas aeruginosa sur les cellules des voies respiratoires épithéliales humaines (cellules CFBE) en culture. Dans la première méthode (appelée le modèle de biofilm statique co-culture), P. aeruginosa est incubé avec des cellules cultivées comme CFBE monocouches confluentes sur le standard des plaques de culture tissulaire. Bien que la bactérie est très toxique pour les cellules épithéliales, l'ajout de retards arginine la destruction de la monocouche assez longtemps pour former des biofilms sur les cellules CFBE. La deuxième méthode (appelée la cellule de flux biofilm modèle de co-culture), implique l'adaptation d'un appareil cellulaire biofilm flux, ce qui est souvent utilisé dans un biofilm de recherche, pour accueillir une lamelle de verre supportant une monocouche confluente de cellules CFBE. Cette monocouche est inoculé avec P. aeruginosa et une pompe péristaltique s'écoule ensuite du milieu frais à travers les cellules. Dans les deux systèmes, les biofilms bactériens se forment dans les 6-8 heures après l'inoculation. Visualisation du biofilm est renforcée par l'utilisation de P. aeruginosa souches exprimant de manière constitutive la protéine fluorescente verte (GFP). Les analyses statique et dynamique cellulaire biofilm co-culture sont des systèmes modèles pour le début de P. l'infection aeruginosa de la fibrose (FC) pulmonaires kystique, et ces techniques permettent différents aspects de P. formation d'un biofilm aeruginosa et de la virulence d'être étudiée, y compris la cytotoxicité du biofilm, la mesure du biofilm UFC, et la coloration et la visualisation du biofilm.
Protocol
Discussion
Les biofilms sont des communautés de bactéries qui se forment en réponse aux stimuli environnementaux. Ces signaux environnementaux mondiaux conduire à des changements réglementaires au sein de chaque bactérie, résultant en se liant à une surface, l'agrégation, la production d'exopolysaccharides et d'autres phénotypes tels que la résistance aux antibiotiques a augmenté de 10. Au cours des deux dernières décennies, beaucoup de preuves a soutenu l'hypothèse que les biofilms jouent…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier G. O Toole pour obtenir des conseils et des suggestions dans le développement de ces modèles. Ce travail a été soutenu par la Cystic Fibrosis Foundation (ANDERS06F0 au GGA, STANTO07RO et STANTO08GA au BAS), les National Institutes of Health (T32A107363 au GGA et R01-HL074175 au BAS), et le Centre national pour les Centres de Ressources de recherche d'excellence en recherche biomédicale (COBRE P20-RR018787 au BAS).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs, Butler, PA | 060319131616 | ||
| FCS2 chamber controller | Bioptechs, Butler, PA | 060319-2-0303 | ||
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs, Butler, PA | PH 40-1313-0319 | ||
| MEM | Mediatech, Manassass, VA | #10-010-CV | ||
| MEM without phenol red | Mediatech, Manassass, VA | Mediatech, Manassass, VA |
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